[发明专利]ALK、RET和ROS融合物的多重PCR检测

说明书

本文提供了以非常高的灵敏度和特异性多重检测大量可起作用的基因融合物的方法和组合物。本方法和组合物可以检测ALK、RET和ROS1基因融合物，任选地与其他突变和融合物的组合。

发明背景

许多癌症与基因融合物相关(Yoshihara等人(2015) Oncogene 34:4845)。最早报道的实例可能是在60年代，BCR-ABL与慢性骨髓性白血病(CML)的关联(Nowell和Hungerford(1960)，J. Natl. Cancer Inst. 25:85)。从那以后，已经报道了许多不同组织中的癌症的数百个基因融合物(Presner和Chinnaiyan(2009)，Curr. Opin Genet. Dev. 19:82)。

另一个实例是酪氨酸受体激酶ALK(间变性淋巴瘤激酶)。EML4-ALK(棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶)融合物与非小细胞肺癌(NSCLC)相关。在这种情况下，ALK的N末端细胞外部分被替换为EML4(KIF5B、HIP1、KLC1、TFG也可以以类似的方式与ALK融合)。所得的融合基因的表达由强EML4启动子驱动，导致ALK的细胞内酪氨酸激酶结构域的更高表达。另外，EML4形成卷曲螺旋，其导致配体非依赖性二聚化和ALK酪氨酸激酶结构域的组成性活化。活化的激酶融合物的额外实例涉及RET (转染期间重排基因)和ROS1。

基因融合物的检测可用于指导治疗。大多数检测方法需要肿瘤组织的活检，这对尤其是后期的许多癌症患者是不可行的。活检组织切片中的检测通常通过荧光原位杂交(FISH)或免疫组织化学(IHC)来进行。所述测试具有高假阳性率和背景，部分是因为在切片过程期间的剪切。因此，要求熟练的细胞学家观察多个组织切片，这需要来自虚弱患者的相当大的活检。类似地，使用RT-PCR的困难是来自肿瘤组织的遗传材料的数量和质量，所述肿瘤组织例如呈福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)形式。参见例如Liu等人(2015)，PLoSOne10: e0117032。

因为检测是时间和资源密集的，所以测试率相对较低。与ALK融合物相关的癌症对ALK抑制剂(例如克唑替尼和色瑞替尼)非常敏感。具有转录期间重排基因(RET)的基因融合物，例如与KIF5B或CCDC6的基因融合物，对于例如用范德他尼的治疗也是敏感的(参见Matsubara等人，(2007)，J. Thorac. Oncol. 7:1872)。基因融合物的低测试率因此代表了治疗机会的大量损失。

发明概述

本文提供了用于检测融合基因、尤其是涉及ALK、RET和ROS1的那些融合基因的多重方法和组合物。

本文提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；(C)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ROS1融合基因；和(D)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。进一步提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种ALK融合基因；(B)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(C)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。本文提供了多重测定组合物，其包含：(A)至少一种引物组和标记探针，其特异性扩增和检测至少一种RET融合基因；和(B)引物组和标记探针，其特异性扩增和检测内部对照。