[发明专利]引物组合及其在制备猪蓝耳病毒美洲型高致病株的检测产品中的应用

说明书

本发明提供了一种特异性检测猪蓝耳病毒美洲型高致病株(HP‑PRRSV)的实时荧光RT‑LAMP引物组和检测方法。使用RT‑LAMP技术在实时荧光PCR仪中实时检测样品中的HP‑PRRSV。本发明筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，比其它PCR方法具有更高的特异性。该套引物能精准检测猪蓝耳美洲型高致病株，与美洲型经典株、疫苗株(TJM‑F92)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)等无交叉反应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及引物组合及其在制备猪蓝耳病毒美洲型高致病株的检测产品中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的猪急性接触性传染病，主要表现为发热、厌食、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔以及仔猪的呼吸道症状。部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色，所以也称为猪蓝耳病。根据病原特性或从不同地域分离的PRRSV毒株序列分析表明，PRRSV共有2种基因型，一种是以VR-2332毒株为代表的美洲型，一种是以Lelysta virus为代表的欧洲型，且不同毒株间的抗原性和致病性存在明显差别。而依据其致病力的不同，又可将其中的美洲型猪蓝耳病毒分为经典株和高致病性株(HP-PRRSV)两种亚型。

PRRSV属于套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员，为单股正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，包括10个开放阅读框(ORF)。其中，ORF1编码病毒的RNA复制酶，是PRRSV产生的唯一非结构蛋白，即ORF1a、ORF1b及Nsp2-12。其中Nsp2是PRRSV的高变基因，其变异在PRRSV变异衍化过程中起到重要作用。而HP-PRRSV就是由Nsp2基因不连续缺失30个氨基酸导致的。

自2006年以来，我国爆发了高致病性PRRS(HP-PRRS)，随后该病迅速在我国各主要养猪省份蔓延。据初步统计，HP-PRRS感染猪的发病率达50％以上，病死率可达30％以上，造成了重大的经济损失。与经典PRRSV相比，HP-PRRSV对猪的致病性明显增强。随着疫情的爆发，疫苗已开始大规模使用。目前国内使用最多的疫苗是TJM-F92。但是疫苗会在猪体内长时间存活，给高致病性猪蓝耳病诊断带来了很多困扰。

传统PRRSV诊断方法要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、常规RT-PCR等。但这些方法在敏感性、特异性、时效性上都存在一些问题。比如病毒分离鉴定，操作繁琐，费时费力，ELISA等血清实验存在交叉反映，且灵敏度低。常规RT-PCR需要进行后续电泳鉴定，操作耗时较长。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。Imai等人于2007年建立了快速诊断H5N1禽流感病毒的RT-LAMP检测体系。实现了一步法检测病毒RNA的方法，大大节省了检测时间。反应结果可通过肉眼观察，但是肉眼观察存在人为误差，在病毒量少时不能够准确判定。也有研究者在反应结束后的体系中加入SYBR Green I染料的方法来检测扩增产物，但此过程必须开盖添加染料，极其容易污染环境；此外在反映前加入荧光染色试剂，在紫外灯下观察，但此方法对弱阳性的判断不够准确。

发明内容