[发明专利]一种外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，且公开了一种外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明，所述试剂包括以下组分：NK细胞扩增试剂：γ射线灭活的重组K562饲养细胞，CD52抗体，IL‑2，CD16抗体，CD3抗体和CD56抗体，γ射线灭活的重组K562饲养细胞为经过100Gγ射线辐射致死的膜表达41BBL，IL‑15的K562细胞系，该外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明，制备得到的NK细胞，具有很高的纯度和杀伤活性，经检测培养至14天时，NK细胞纯度可以达到90%以上，当效靶比为10:1时，NK细胞对K562细胞的杀伤活性可以达到80%以上，制备的NK细胞增殖速度快，培养至14‑17天细胞扩增倍数达500以上，本发明制备的NK细胞有很好的靶向杀伤肿瘤细胞的效果。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明。

背景技术

NK细胞即自然杀伤细，1975年被发现，属于非吞噬淋巴细胞，胞浆富含穿孔素和颗粒酶，具有识别和溶解肿瘤细胞的功能，目前，癌症已经成为全球第一死亡原因。常规治疗癌症的手段有：手术、放疗和化疗三种方式。常规的治疗方式虽然可以在短时间内有效减轻肿瘤负荷，但因为不能有效的清除肿瘤细胞和微小病灶，化疗产生的耐药、放疗的肿瘤转移等使肿瘤的临床效果不佳，肿瘤复发比例增多。免疫细胞治疗是继手术、化疗和放疗之后的第四大治疗肿瘤的新方式，其能系统杀灭肿瘤细胞，有效抑制肿瘤细胞的转移，副反应小，临床效果好。免疫细胞治疗应用于临床的有DC细胞、CIK细胞、细胞和NK细胞。NK细胞是第三类淋巴细胞，不同于T/B淋巴细胞，无需抗原刺激即可发挥细胞毒效应，能自发溶解多种肿瘤细胞和被病毒感染的细胞，还可以分泌多种细胞因子和趋化因子参与免疫调节。NK细胞的免疫治疗在抗病毒，抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。近些年，临床上将NK细胞用于免疫治疗的例子在不断增多。

目前，体外扩增NK系统主要通过以下三种方法：一是采用免疫磁珠的方法从PBMC中将NK细胞分离出来再培养；二单纯的细胞因子组合刺激PBMC中NK细胞的扩增。三采用饲养细胞（基因修饰）的方法培养PBMC中的NK细胞；采用免疫磁珠的方法可以快速的获得少量NK细胞，只能用于NK细胞研究，量少不适用于临床，且成本高，操作复杂；现有的因子组合，NK细胞扩增倍数在150倍左右，NK细胞纯度在50%左右，数量和纯度上都无法满足治疗性回输的要求，采用饲养细胞培养NK细胞可以获得高纯度NK细胞，但容易引来外来细胞系污染；本发明综合第二种和第三种方法，用γ射线彻底灭活处理的GE-K562细胞与细胞因子联合应用，筛选出最优组合。该组合在刺激NK细胞的数量和细胞杀伤功能上比传统的扩增方法有较大改进，可以获得大量高纯度的安全有效的可用于临床治疗的NK细胞。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明，试剂由γ射线灭活的饲养细胞和细胞因子组合而成，通过本发明的试剂扩增就可以得到大量高杀伤活性的NK细胞，培养过程简单，完全可以满足临床需要。

（二）技术方案

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种外周血NK细胞体外高效扩增试剂及操作说明，所述试剂包括以下组分：NK细胞扩增试剂：γ射线灭活的重组K562饲养细胞，CD52抗体，IL-2，CD16抗体，CD3抗体和CD56抗体。

进一步的，所述γ射线灭活的重组K562饲养细胞为经过100Gγ射线辐射致死的膜表达41BBL和IL-15的K562细胞系。

进一步的，所述试剂的组成和含量为：灭活GE-K562细胞量为2^107cells，CD52抗体600ng，IL-2 800U，CD16mAb600ng，CD3mAb200ng和CD56mAb200ng。