[发明专利]一种pH稳定性提高的转氨酶突变体

说明书

本发明涉及一种pH稳定性提高的转氨酶突变体，属于蛋白质工程技术领域。通过对转氨酶晶体结构的分析，对活性口袋上方loop区域的高柔性残基(R131，P132，E133)进行饱和突变进化，在高通量的筛选下，获得三个突变体(R131A，R131C和R131D)，所对应的突变体氨基酸序列依次为SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4。本发明所述的pH稳定性提高的转氨酶突变体能够在pH 9.5的条件下，保持高催化活性，进一步提高转氨酶在手性胺类医药中间体的工业化应用潜力。

技术领域：

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种pH稳定性提高的转氨酶突变体。

背景技术：

转氨酶(amine transaminase：ATA)是一种可逆地催化氨基与酮基互换的转移酶，由转氨酶催化生成的产物具有光学纯度高、立体选择性强等优点。随着手性胺类药物的需求量日趋增大，使得选择性转氨酶的研究有了更大开发价值。近年来，大量的天然转氨酶相继被挖掘出来，但通常存在催化效率低、立体选择性差、稳定性弱等缺点，严重限制了产业化应用。

最早，Codexis公司在专利US8293507中公开，对来源于节杆菌的氨基转移酶(ATA117)进行改造，经过11轮的定点饱和突变以及条件优化，最终获得的转氨酶包含了27个位点突变，且成功用于西他列汀药物的生产，这项研究成果为转氨酶在制备手性胺类医药中间体的推广应用带来了信心。

此外，Andezej lyskowski等人在文献Crystal Structure of an(R)-Selectivev-Transaminase from Aspergillus terreus，PLoS One,2014,9(1):e87350中报道了转氨酶的晶体结构，为同源二聚体(见图1)。

黄俊等人在文献Biochemical and biophysical research communications,2017,483(1):397-402中报道了关于Aspergillus terreus ATA的热稳定性，但野生型在38℃半衰期仅仅10min，通过改造突变，T1050也只有3.5℃的提高，变化并不大。

黄俊等人在专利CN105950581中公开，通过理性引入二硫键提高其稳定性，但结果半衰期的时间仅延长了3.5min。在工业的应用中，转氨酶的催化时间通常控制在24～48h之间，低的稳定性也是限制转氨酶产业化的一大障碍。

另外，转氨酶的催化反应过程中需要有氨基供体参与，异丙胺因为分子结构简单、价格便宜，是常用的氨基供体，但异丙胺具有强碱性，在反应过程中会导致酶的不稳定，需要用大量酸性试剂来调整pH。如果转氨酶具有高pH的稳定性，不仅可以减少原料的使用，同时在高pH条件下副反应少，反应过程污染机会降低。

但关于提高Aspergillus terreus ATA在高pH的稳定性改造，至今未见报道，如果能够提高转氨酶在pH 9.5催化条件下的稳定性，将会进一步加快转氨酶的产业化步伐。

发明内容：

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种pH稳定性提高的转氨酶突变体。

一方面，本发明提供的转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列的突变位点为第131位的精氨酸突变为丙氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸。

进一步，转氨酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或者SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

进一步，转氨酶来源于Aspergillus terreus。

更进一步，转氨酶突变体相对于野生型在pH 9.5的条件下，活性可维持在24h内使得转化率达90％。

进一步，基因编码如权利要求1所述的转氨酶突变体。