[发明专利]荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)待检测样本固定好后，使用蛋白酶处理体系通透细胞，清洗；

(2)使用二类限制性内切酶处理体系处理细胞基因组DNA，暴露平末端，清洗；

(3)使用核酸外切酶处理体系，从平末端开始沿着5`-3`方向降解单链DNA，保留另一条基因组单链DNA，清洗；

(4)使用探针结合处理体系，荧光探针结合在上一步中保留的基因组单链DNA上，清洗；

(5)使用连接酶处理体系，将探针形成环状DNA，清洗；

(6)使用乙醇脱水处理体系，固定单链基因组DNA和环状探针DNA；

(7)使用聚合酶处理体系，环状探针DNA以单链基因组DNA结合位置为起点，在聚合酶的作用下进行大量自我复制，产生60-70kb左右的含重复序列的单链DNA，清洗；

(8)使用荧光探针结合处理体系，大量的荧光探针结合在含重复序列的单链DNA上，清洗；

(9)使用封片处理体系，封片；

(10)最终在荧光显微镜下观察记录结果。

2.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述的二类限制性内切酶处理体系具体包括：10xCutSmart buffer、10xBSA、SspI酶和无核酸酶超纯水。

3.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述的探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20xSSC、鲑鱼精子DNA、探针序列5`Pho-TGATGAGCTGCACGGTTCCTTTTACGACTGCGAATACGCATCCACGCGATTCTTCGGGCATGAGCTGCA-3`和无核酸酶超纯水。

4.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述连接酶处理体系具体包括：10xT4 DNA Ligase buffer、100mM ATP、10xBSA、T4 DNA连接酶和无核酸酶超纯水。

5.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述梯度乙醇脱水体系具体包括：乙醇和超纯水。

6.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述聚合酶处理体系具体包括：10x DNA polymerase buffer、100mM DTT、10mMdNTPs、10x BSA、甘油、DNA聚合酶和无核酸酶超纯水。

7.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述荧光探针结合处理体系具体包括：甲酰胺、20x SSC、鲑鱼精子DNA、荧光探针序列5`Cy3-CTGCGAATACGCATCCACGCGAT-3`和无核酸酶超纯水。

8.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于，所述封片处理体系具体包括：DAPI、抗淬灭剂、甘油和无核酸酶超纯水。

9.根据权利要求1所述的荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的方法，其特征在于所述清洗处理体系具体包括：Tris-HCl、NaCl、Tween20和无核酸酶超纯水。

10.一种荧光原位检测人EGFR基因20号外显子p.T790M突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-10任一项所述的蛋白酶处理体系、二类限制性内切酶处理体系、核酸外切酶处理体系、探针结合处理体系、连接酶处理体系、梯度乙醇脱水体系、聚合酶处理体系、荧光探针结合处理体系、封片处理体系和洗液处理体系。