[发明专利]一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法

说明书

本发明公开了一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法，该方法采用的引物组由F3、B3、FIP、BIP组成，F3：GCCTGTTCGAGCGTCATT，B3：TCAGCGGGTATCCCTACC，FIP：CGCTTGAGGCAAGACGCCACGCTCTGCTTGGTA TTGGGC，BIP：ACATACATCTCGCTTCGGAGCGTCCGAGG TCAACCTTGAGAA。本发明的检测方法简便有效，极大地提高了检测效率，降低了检测成本。

技术领域

本发明涉及一种杨树真菌性溃疡病菌环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

国内外报道的杨树溃疡病(poplar canker disease)的病原菌种类很多(袁嗣令1984)，而我国杨树溃疡病绝大多数由真菌引起(许文力等1997)，对林业生产造成巨大损失的溃疡病害的病原主要是葡萄座腔菌属Botryosphaeria(引起水泡型溃疡病)，由葡萄座腔菌 (Botryosphaeria dothidea)引起的杨树水泡型溃疡病主要发生在主干和大枝上，发病初期在光皮杨树品种树皮上的皮孔边缘形成近圆形小泡状病斑，随后病斑逐渐变大至直径为 1cm左右的圆形小泡，按压之有无色液体流出；在粗皮杨树上则多形成有红褐色液体流出的水渍状病斑，后期病斑失水干瘪形成一个圆形稍下陷的坏死斑，黑褐色。发病严重时，病斑连接成片，布满整个树干，最后枝干枯死。该类杨树溃疡病在我国广泛分布，严重影响着我们杨树人工林的健康持续发展。

目前在杨树真菌性溃疡病菌的检测上，较常用的方法有两种，一种是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30～35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(PCR仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员有较高技术要求，大大限制了作为快速诊断方法的使用和推广；另一种是血清学检测方法，例如ELISA通过酶的高效催化作用与底物发生显色反应，从而定性或者定量鉴定不同真菌，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification)是2000年日本学者Notomi 等人新发明的一种核酸特异性序列体外等温扩增技术。LAMP技术的关键在于引物的设计。与传统PCR引物相比较其特异性在于普通的真菌PCR引物只有正向引物和反向引物两种，两种引物分别沿模板连的5’端和3’端按碱基互补配对的原则扩增，而LAMP引物是主要是针对要扩增的靶基因的六个不同的区域设计的，分别是基于靶基因3’端的FlC区、F2C区和F3C区以及基于靶基因5’端的Bl区、B2区和B3区等6个不同的区域位点设计的4种引物该技术已在各种检测鉴定技术中被证明有着不可比拟的优势并且得到迅速发展，尤其在食物病原细菌以及口腔细菌的检测鉴定中发展迅速。LAMP技术的主要特点在于用两对特殊设计的引物(一对内引物，一对外引物)和具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA 聚合酶)在反应中在模板两端的引物结合处不断重复出现单链环状结构，并且使引物可以在等温条件下与模板结合进行连置换扩增反应。与传统的PCR技术相比较，LAMP技术克服了传统PCR要通过反复热变性以获取单链模板的缺点，大大节省了反应时间，实现了等温条件下的连续快速扩增，并且其灵敏度与传统的PCR技术相比有了很大的提高；同时， LAMP引物为2对特异性引物，2对引物是针对靶基因的六个区域设计的，这就使LAMP 扩增有较高的特异性。LAMP扩增结果的检测有多种方法：扩增产物电泳检测会出现特征性的阶梯状条带；扩增产物中加入Mg²⁺肉眼可见白色浑浊物；扩增产物中加入荧光染料钙黄绿素混匀后，在肉眼中可见绿色荧光。

针对引起杨树溃疡病的葡萄座腔菌属的LAMP检测，并未有文献报道。关于葡萄座腔菌的LAMP检测，有研究根据茶藨子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物，并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度，然而该研究采用LAMP检测茶藨子的葡萄座腔菌的最低检测限仅为1pg/μL，灵敏度较低，从而无法应用于杨树真菌性溃疡病菌的检测。