[发明专利]一种多酶耦合制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的方法

权利要求书

1.一种多酶耦合制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸(I)的方法，

所述方法包括如下步骤：

以1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸外消旋体或1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐的外消旋体为底物，使该底物中(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸在氧化脱氢酶的催化作用下反应生成式(II)所示的亚胺酸；

所述氧化脱氢酶为D-氨基酸氧化酶，所述D-氨基酸氧化酶具有如SEQ IDNO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；

使所述式(II)所示的亚胺酸在哌啶酸还原酶与能够供给氢负离子的辅酶的存在下转化为所述(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸；

所述哌啶酸还原酶具有如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸盐为1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸的碱金属盐或铵盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-氨基酸氧化酶的使用形式为离体的D-氨基酸氧化酶，或者离体的D-氨基酸氧化酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶，或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达D-氨基酸氧化酶且含有表达载体pET-28a(+)的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)；其中，所述D-氨基酸氧化酶基因连接在所述表达载体pET-28a(+)上。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哌啶酸还原酶的使用形式为离体的哌啶酸还原酶，含有离体的哌啶酸还原酶的粗酶液或者纯酶或者固定化酶，或胞内表达哌啶酸还原酶的细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达哌啶酸还原酶且含有表达载体pET-28a(+)的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)；其中，所述哌啶酸还原酶基因连接在所述表达载体pET-28a(+)上。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能够供给氢负离子的辅酶为NADH和/或NADPH。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述生成亚胺酸的反应还在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的存在下进行。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使所述生成亚胺酸的反应还在过氧化氢酶的存在下进行。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使生成所述亚胺酸的反应在设定温度和有氧环境中进行，所述设定温度为20～70℃。

11.如权利要求1或10所述的方法，其特征在于，所述方法的实施过程包括：首先构建反应体系，然后控制所述反应体系处于设定温度和有氧环境中进行反应，所述反应体系包括所述底物、所述氧化脱氢酶、所述哌啶酸还原酶、辅酶、辅酶再生系统、溶剂，所述反应体系还选择性地包括pH缓冲剂和/或pH调节剂，所述辅酶包括NAD⁺和/或NADH，或者，所述辅酶包括NADP⁺和/或NADPH。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生系统包括辅酶再生酶和辅酶再生底物。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述辅酶再生酶为葡萄糖脱氢酶，所述辅酶再生底物为葡萄糖；或者，所述辅酶再生酶为醇脱氢酶，所述辅酶再生底物为异丙醇。