[发明专利]一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于慢病毒RCL检测的引物对、探针、试剂盒及其检测方法，所述引物对的序列分别包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述探针序列为如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明所提供的引物对和探针序列，特异性强，灵敏度和重复性高，所述检测方法检测周期短，检测精度高，可检测出的样本浓度下限低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测慢病毒RCL的引物、探针及检测方法。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，其是目前应用最广泛的基因运载工具之一，在基因治疗研究和转基因动物的制备中已显示出其广阔的应用前景。但是，操作慢病毒载体仍有一些隐患，主要在于：(a)可能产生自我复制的有感染能力的慢病毒(RCL)；(b)肿瘤生成的潜在可能性；(c)转基因的潜在毒性。

为了改善慢病毒的生物安全，人们做出了很大的努力。其中，针对主要可获得的商品化慢病毒系统——第二和第三代慢病毒系统，采取了很多安全措施以降低风险。主要包括：通过去除辅助基因减少或消除HIV-1致病性；通过包装蛋白和酶用不同的载体表达来减少包装构建体之间的同源性，以降低同源重组的可能性。此外，由于剔除了3'LTR，慢病毒自身是无活性的，以上措施的施用减少了病毒同源重组和动员整合载体的可能性。

随着慢病毒在基因治疗和细胞治疗中的应用，慢病毒载体在医学中显示出了希望。然而，由于插入突变有产生有复制能力病毒的潜在风险，慢病毒载体的安全性和遗传毒性已成为阻碍其用于治疗的主要原因。Paul Escarpe等人使用VSV Gag基因表型假型病毒作为慢病毒RCL的标准来进行检测，该方法通过将载体样品在细胞系C8166-45暴露于7天以增加RCL感染和扩增的机会，然后将培养物定期稀释六次以允许RCL扩增，每次收集培养上清液样品，通过测量p24衣壳蛋白浓度来分析病毒的复制情况。此方法操作繁琐复杂，检测周期过长，且不能快速检测出慢病毒RCL。

因此，提供一种操作简单、检测周期短且灵敏度高的慢病毒RCL检测方法是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，针对VSV Gag基因设计了用于检测慢病毒RCL的一对特异性引物和探针，并结合标准阳性质粒，通过荧光定量PCR方法能对慢病毒进行快速、准确的检测，从而完成了本发明。

具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：

第一方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的引物对，其中，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述反向引物的序列包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

第二方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的探针，其中，所述探针序列为如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

第三方面，提供了一种用于检测慢病毒RCL的试剂盒，其中，所述试剂盒包括第一方面所述的引物对和第二方面所述的探针。

其中，所述试剂盒还包括标准阳性质粒、PCR反应体系和酶体系。

其中，所述标准阳性质粒的制备方法包括以下步骤：

步骤i，获取慢病毒RCL的靶序列片段；

步骤ii，构建包含上述靶序列片段的重组质粒；

步骤iii，测定重组质粒的浓度，并计算相应拷贝数，得到标准阳性质粒。

其中，所述PCR反应体系包括缓冲液(Buffer)、MgCl2、dNTPs；所述酶体系包括反转录酶和热启动DNA聚合酶。

其中，步骤i包括以下子步骤：