[发明专利]一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法

说明书

本发明涉及一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法及其应用，包括：肽酶的固定化；利用固定化酶反应器酶解多肽。首先将氨肽酶和羧肽酶分别制成固定化酶反应器，再利用固定化酶反应器从多肽的C端或者N端进行酶解，从而得到氨基酸序列连续的多肽酶解产物。本发明优点是：使用固定化酶反应器酶解效率高；使用该方法可获得酶解后氨基酸序列连续的产物；方法所制得的固定化酶反应器易于保存，可重复使用。

技术领域

本发明涉及多肽的水解酶水解方法，即一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，以实现获得连续的肽酶酶解产物。

背景技术

对蛋白质的氨基酸序列的测定是蛋白质组学领域中的重要技术之一，蛋白质以及多肽测序的传统方式主要是对DNA的序列分析和Edman降解测序。Edman降解是化学法对多肽进行末端水解，通过使多肽N末端与异硫氰酸苯酯反应，在酸性环境中可使N末端氨基酸脱落，从而达到逐个水解氨基酸的目的，通过液相色谱法检测氨基酸种类，从而得到肽段N段的若干氨基酸序列。但此方法只能从多肽N端水解并且无法水解N末端被封闭的的多肽。除了化学法肽酶酶解法也可对多肽进行末端水解，是通过利用羧肽酶或氨肽酶与多肽反应，使多肽C末端或N末端的氨基酸残基水解，通过质谱检测酶解前后多肽的分离量差异，从而确定氨基酸种类，最终确定多肽C端和N段的氨基酸序列。但在自由溶液中进行肽酶水解，无法控制多肽的水解程度，水解产物氨基酸序列不具有连续性。

为克服以上方法存在的问题，我们选择利用肽酶固定化酶反应器对多肽进行酶解，通过控制流速来改变多肽的酶解程度，以实现高效酶解并获得氨基酸序列连续的酶解产物。

发明内容

本发明发展了一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，酶解效率高，可获得连续的酶解产物，可重复使用。

为了实现该目的，本发明的技术方案是：

一种用于序列测定的基于固定化肽酶反应器酶解方法，包括：利用固定化羧肽酶反应器和固定化氨肽酶反应器酶解多肽。

所述的酶解方法，1)将肽酶固定在石英毛细管柱中；2)使用固定化羧肽酶和氨肽酶对多肽进行酶解。

所述的方法，1)将肽酶固定在石英毛细管柱中，其具体步骤如下：

将羧肽酶溶在pH 3-10的缓冲液中，羧肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到羧肽酶固定化酶反应器；

将氨肽酶溶在pH 3-10的缓冲液中，氨肽酶终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液A，在温度为4℃-10℃时向毛细管柱中通入溶液A，流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，再用1-3mL水以流速10μL/min冲洗100min，得到氨肽酶固定化酶反应器；

2)使用固定化酶反应器对多肽进行酶解，其具体步骤如下：

将多肽溶解在pH 3-10的缓冲液中，多肽终浓度为0.001-1mg/mL，得到溶液B，将溶液B在离心并取其上清得到溶液C；

将溶液C先后分别通入羧肽酶固定化酶反应器和氨肽酶固定化酶反应器；

流速为0.01-20μL/min，通入时间为30-720min，反应温度为20-90℃。

将溶液C先通入羧肽酶固定化酶反应器、后通入氨肽酶固定化酶反应器；或将溶液C先通入氨肽酶固定化酶反应器、后通入羧肽酶固定化酶反应器。

羧肽酶包括但不限于羧肽酶Y、羧肽酶A和羧肽酶B中的一种或两种。

所述的石英毛细管柱包括但不限于开管柱、整体柱和填充柱中的一种或两种以上。