[发明专利]一种检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒

说明书

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测人运动神经元存活基因拷贝数的试剂盒。本发明提供种多重荧光PCR法检测人运动神经元存活基因的拷贝数，分别设计SMN1基因第7及第8外显子、SMN2基因第7及第8外显子、SMN基因第6外显子和内参基因CFTR的特异性引物和探针。本发明的设计巧妙，可通过3个独立PCR反应分别对SMN1基因第7及第8外显子、SMN2基因第7及第8外显子、SMN基因第6外显子进行拷贝数的相对定量。本发明操作简便、特异性强、灵敏度佳，SMN基因第6外显子拷贝数结果，可提升结果的准确性，更适合用于临床脊髓性肌萎缩症患者的分型及携带者的筛查。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测人运动神经元存活基因拷贝数的试剂盒。

背景技术

脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA），为一种常见的常染色体隐性遗传疾病，因位于第五号染色体（5q13）的人运动神经元存活基因1（Survival of MotorNeuron 1, SMN1）产生大片段缺失、转换或点突变等，其中95%以上为第7号外显子和/或第8号外显子大片段缺失；导致渐进性退化、对称性肌肉无力、萎缩等病征。新生儿发病率为1/6,000~1/10,000，在正常人群中携带率为1/40~1/60。根据临床症状与发病年龄可将SMA分为四型，其中I~III型称为儿童型SMA：SMA I型为最严重的亚型，患者在出生后6个月内发病，一般生存期在2岁以内；SMA II型为中度型，患者通常在6~18个月内发病，其生存期仰赖于外来健康支援照护，可存活至成年；SMA III型为轻度型，患者由出生后18个月至成年都有可能发病，其病情进展较为缓慢，最终仍死于呼吸肌麻痹，SMA IV型为成人型，30岁后发病，症状轻微，生存期正常。该病居致死性常染色体隐性遗传病的第二名，目前尚无治疗手段。

目前的研究已确立SMA的致病决定基因为SMN1基因缺陷，其中SMN2基因拷贝数与SMA表型的轻重直接相关。透过SMN基因拷贝数的相对定量检测，应用于产前筛查可有效预防出生缺陷，降低社会照护成本；抑或是对患者分型诊断皆具有临床评价意义。

现有的SMA致病基因诊断技术包含：聚合酶链反应─单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应─限制酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相分析(DHPLC)、高分辨熔解曲线(HRM)、多重连接探针扩增(MLPA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)等技术。然而，PCR-RFLP仅适用于检测SMN1基因的纯合缺失，无法辨识出SMN1基因杂合缺失的SMA致病基因携带者的正常人；无论是DHPLC与MLPA均需在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后续处理分析，在操作过程中容易造成环境污染。

目前临床上SMA的常规检测多使用荷兰MRC公司生产的多重连接探针扩增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)检测试剂盒，该试剂盒使用多组参考探针对SMN基因拷贝数进行半定量检测，然而MLPA所需的设备门槛与试剂成本高。因此本发明于多重荧光PCR的技术上，除了检测SMN1基因、SMN2基因第7及第8外显子的拷贝数外，增加SMN基因第6外显子拷贝数的相对定量以复核SMN1基因与SMN2基因的拷贝数结果，在提高操作便利性的同时也增加整体检测结果的准确度。

随着我国出生缺陷防控政策的相继执行，SMA致病机制与分子机制也已明朗，因此开发准确可靠、便利经济，同时能实现标准化、规模化的检测试剂盒，进行SMN1基因、SMN2基因状态的识别，对SMA的防治与筛查及患者的分型诊断为首当之务。

发明内容

本发明的目的针对现有技术的不便与不足，提供一种多重实时荧光PCR法检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：