[发明专利]一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法

说明书

本发明公开一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法，即采用ST2⁺肠毒素基因型大肠杆菌基因组DNA作为阳性对照，超纯水作为阴性对照，以样品基因组DNA为模板，进行LAMP检测，LAMP检测引物分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.4所示；然后向扩增产物中加入1000×SYBR Green I荧光染料，若出现绿色，则说明样品中含大肠杆菌；反之，则认为样品中不含大肠杆菌；本发明方法操作简单、快速便捷、灵敏度高、特异性强，为基层大肠杆菌的快速检测提供了新的技术平台。

技术领域

本发明涉及动物病原快速诊断技术领域，特别是一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法。

背景技术

新生仔猪腹泻一直以来是危害养猪业的重要疾病，虽然引起仔猪腹泻的原因比较复杂，但致病性大肠杆菌是引起仔猪腹泻的重要病原菌。目前对大肠杆菌的检测方法主要有传统的分离鉴定、免疫血清学检测以及传统的PCR方法等，但这些方法检测步骤复杂、耗时长、灵敏度较低且对检测环境要求严格，不能满足基层现场快速准确检测的要求。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等发现的一种恒温核酸扩增技术，与传统的PCR技术相比，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上。LAMP技术通过4条特异性引物对目的序列的6个区域退火杂交，利用Bst DNA聚合酶的催化作用，在恒温条件下（60~65℃）温育30~60 min，实现对目标序列的批量扩增。其反应结果可直接通过肉眼观察是否有白色焦磷酸镁沉淀产生进行判断，也可通过添加羟基萘酚蓝（HNB）、溴化乙淀(EB)、钙黄绿素或SYBR Green I等荧光染料进行显色观察。近年来，关于LAMP技术的研究已经取得了较大的进展，已经在细菌检测、病毒检测、寄生虫检测、真菌和支原体检测、动物胚胎性别鉴定、转基因食品检测以及肿瘤基因检测中广泛应用。

大肠杆菌的肠毒素是其在生长繁殖过程中产生和释放的一种外毒素，大肠杆菌肠毒素ST2（heat-stable enterotoxin type II，耐热肠毒素II型）的确切作用机制尚不清楚，但可引起9周龄以下断乳小猪的肠积水，国内现已开发出了针对该毒素的多重PCR检测方法，但目前，基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法尚未见报道。

发明内容

针对现有新生仔猪源大肠杆菌检测中耗时长、灵敏度低的问题，本发明针对大肠杆菌肠毒素ST2基因保守序列设计LAMP引物，分别对体系中Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度、dNTP浓度、内引物浓度、Bst DNA聚合酶添加量以及反应温度和反应时间等因素进行研究，最终确定各体系中各因素的浓度，建立了检测大肠杆菌肠毒素基因的LAMP方法，实现新生仔猪源大肠杆菌现场快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于肠毒素基因的新生仔猪源大肠杆菌LAMP检测方法，其具体步骤如下：

⑴ 病料细菌基因组模板DNA的提取：

取1 mL细菌分离培养物于1.5 mL离心管中，在冷冻离心机中，4℃，以12000 rpm离心5min，弃去上清；将菌体沉淀重悬于100 μL灭菌的超纯水中，用漩涡混合器混匀后；采用煮沸法分别制备各细菌的DNA模板；其具体步骤如下：100℃沸水中煮沸10 min，迅速将其转移至-20℃冷却5 min，12000 rpm离心5 min后，吸取上清转移至无菌指形管中，即可作为模板，﹣20℃条件下保存备用；

TSB培养基：称取TSB粉末30 g，溶解于800 mL蒸馏水，定容至900 mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。

⑵LAMP反应体系及反应程序