[发明专利]一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法在审
| 申请号： | 201811348105.0 | 申请日： | 2018-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN109853046A | 公开（公告）日： | 2019-06-07 |
| 发明（设计）人： | 张建铎;李雪梅;陈章玉;杨光宇;向海英;曾婉俐;张涛;高茜;宋春满;许力;蒋佳芮;邓乐乐;杨文武;贾凌;夏庆友 | 申请（专利权）人： | 云南中烟工业有限责任公司 |
| 主分类号： | C40B50/06 | 分类号： | C40B50/06;C40B40/06;C40B40/08;C12N15/70 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司 53100 | 代理人： | 金耀生;亢能 |
| 地址： | 650231 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 双链 载体库 基因 快速构建 载体构建 构建 质粒 人工合成寡核苷酸 退火 大肠杆菌 功能研究 连接产物 退火原理 物种基因 一次操作 粘性末端 种质资源 重要意义 覆盖度 规模化 均一性 正确率 酶切 引物 转化 开发 | ||
【权利要求书】：
1.一种快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）、基于编辑位点设计特异性sgRNA，并以G碱基开头NGG碱基结尾，长度为20-25nt；
步骤（2）、人工合成步骤（1）中成对互补的寡核苷酸DNA，并分别在上下游引物的5’端加入粘性末端DNA碱基；
步骤（3）、将步骤（2）中的上下游DNA寡核苷酸双链退火，形成双链sgRNA；
步骤（4）、利用T4/T7 DNA连接酶将双链sgRNA连接至酶切线性CRISPR/Cas9质粒中；
步骤（5）、将步骤（4）的连接产物转化大肠杆菌，得到编辑载体库。
2.根据权利要求1所述的快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：步骤（3）中，双链退火具体如下：
用无菌超纯水稀释到100ng/μl，上下游引物各吸取5μl至200μl的PCR管中，移至PCR仪退火，退火完成后加无菌超纯水稀释10倍；
退火程序为：95℃ 5min，-0.1℃/5-10s，退火至25℃。
3.根据权利要求1所述的快速构建CRISPR/Cas9基因编辑载体库的方法，其特征在于：步骤（4）中的CRISPR/Cas9质粒包括Cas9和sgRNA的表达框。
4.权利要求1-3之一的方法得到的编辑载体库。
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