[发明专利]基因敲除质粒、细胞系及制备方法和应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及基因敲除质粒和细胞系，此细胞系能明显抑制细胞rRNA的降解，促进PRV增殖，可以用于抗病毒作用研究。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基因敲除质粒，还涉及细胞系，还涉及此基因敲除质粒和细胞系的制备方法及应用。

背景技术

Ribonuclease L (RNase L) 属于2-5腺苷酸系统，具有核酸内切酶活性，在干扰素的抗病毒过程中发挥着重要的作用，猪RNase L基因全长14326 bp，包含6个外显子，编码744个氨基酸，从结构和功能上可分为氨基端的锚定蛋白区（A区）、中间的激酶样区（K区）和羧基端的RNA酶活性区（N区）三个区域。其中，锚定蛋白区是核酸与蛋白结合的区域，RNA酶活性区是RNase L蛋白中具有酶活性的区域。无活性RNase L的RNA酶活性区和激酶样区形成发夹结构，同时锚定蛋白区与RNA酶活性区以共价键连接，阻止二聚体的形成，从而抑制RNase L的核糖核酸酶活性。

RNase L作为一种核酸内切酶，在先天性免疫过程当中发挥着重要的作用。当病毒感染细胞后，病毒RNA或者DNA在复制和转录过程当中形成的双链RNA（dsRNA）能够激活2’-5’寡聚腺苷酸合成酶（OAS），进而催化ATP合成2’-5’寡聚腺苷酸（2-5A），2-5A能够与RNaseL的锚定蛋白区结合，激活RNase L，暴露出RNA酶活性区和二聚化区域，解除锚定蛋白造成的抑制作用。活化的RNase L能够降解宿主当中的ssRNA（单链RNA），发挥抗病毒作用；降解核糖体RNA，阻断病毒蛋白质的合成；诱导细胞凋亡，控制病毒感染。

鉴于RNase L在先天性免疫当中的关键作用，敲除RNase L基因是其功能研究中十分重要的手段。目前关于猪RNase L（sRNase L）基因的相关研究较少，其功能上的研究仅限于过表达，由于实验方法上的局限性，造成了无法对sRNase L具体功能进行更加深入的研究，为了解决这一问题，十分有必要开发一种从猪细胞基因组中敲除sRNase L基因的方法。CRISPR-Cas9技术是近年来兴起的一种基因编辑技术，其具有操作简单，特异性高的特点，现在成为了科研人员用于研究基因功能和潜在基因治疗应用的重要工具。

发明内容

为了更进一步的研究猪RNase L的相关功能，我们以CRISPR-Cas9技术为基础，开发了一种从基因组中稳定敲除猪RNase L基因的基因敲除质粒Px459M-sRNase L-KO和细胞系sRNase L KO-PK，将为研究猪RNase L功能打下基础。

本发明还提供了所述基因敲除质粒Px459M-sRNase L-KO和细胞系sRNase L KO-PK的制备方法。

本发明还提供了所述细胞系sRNase L KO-PK的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种基因敲除质粒，在Px459质粒的Hind III酶切位点以及距离Hind III酶切位点最远的Bbs I酶切位点之间插入的核苷酸序列见序列表中序列1的核苷酸序列。

一种基因敲除质粒的制备方法，其特征在于是通过以下步骤得到的：

（1）设计两对引物，核苷酸序列如下：

sRNase L-KO-3Fwd: 5’-CACCTTCATGGAAGCCGCCGTGTA-3’，

sRNase L-KO-3Rev: 5’-AAACTACACGGCGGCTTCCATGAA-3’，

sRNase L-KO-4Fwd: 5’-CACCCAGCCGAGCCAACGATAACG-3’，