[发明专利]基因敲除质粒、细胞系及制备方法和应用

权利要求书

1.一种基因敲除质粒，其特征在于在Px459质粒的Hind III酶切位点以及距离HindIII酶切位点最远的BbsI酶切位点之间插入的核苷酸序列见序列表中序列1的核苷酸序列。

2.一种权利要求1中所述基因敲除质粒的制备方法，其特征在于是通过以下步骤得到的：

（1）设计两对引物，核苷酸序列如下：

sRNase L-KO-3Fwd: 5’-CACCTTCATGGAAGCCGCCGTGTA-3’，

sRNase L-KO-3Rev: 5’-AAACTACACGGCGGCTTCCATGAA-3’，

sRNase L-KO-4Fwd: 5’-CACCCAGCCGAGCCAACGATAACG-3’，

sRNase L-KO-4Rev: 5’-AAACCGTTATCGTTGGCTCGGCTG-3’，

将引物sRNase L-KO-3Fwd和sRNase L-KO-3Rev进行磷酸化和退火，得到sRNase L-KO-3P， 将引物sRNase L-KO-4Fwd和sRNase L-KO-4Rev进行磷酸化和退火，得到sRNase L-KO-4P；

（2）构建基因敲除质粒

用BbsI双酶切质粒Px459M，胶回收得到载体片段1，用BbsI双酶切质粒EZ-Guide-XH，胶回收得到载体片段2，将sRNase L-KO-3P和载体片段1相连，得到Px459M-sRNase L-KO-3P，将sRNase L-KO-4P和载体片段2相连，得到EZ-Guide-XH-sRNase L-KO-4P，用Hind III/XhoI双酶切Px459M-sRNase L-KO-3P得到载体片段3，用Hind III/XhoI双酶切EZ-Guide-XH-sRNase L-KO-4P得到基因片段4，将载体片段3和基因片段4连接，得到基因敲除质粒Px459M-sRNase L-KO。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于磷酸化和退火操作如下：反应体系为10µL，含sRNase L-KO-3Fwd和sRNase L-KO-3Rev或sRNase L-KO-4Fwd和sRNase L-KO-4Rev各10 µmoL/L，10×T4 ligase buffer 1 µL，T4 PNK 1 U，H₂O 6 µL；反应条件为：37 ℃ 30min，95 ℃ 5 min，PCR梯度降温至25 ℃，速度为每秒降低0.1 ℃，25 ℃ 5 min，4 ℃ 5min。

4.一种细胞系，其特征在于权利要求1中的基因敲除质粒Px459M-sRNase L-KO转染PK-15细胞，使用含有嘌呤霉素培养基筛选细胞，存活的抗性细胞克隆即为sRNase L KO-PK细胞系。

5.一种权利要求4所述的细胞系在研究猪RNase L的作用机制及抗PRV感染药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述细胞系被poly (I: C)转染，能阻止细胞rRNA降解。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述细胞系促进PRV增殖。