[发明专利]甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，包括如下步骤：1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；2)对步骤1)得到的纯化后的病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；3)将步骤1)得到的纯化后的病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。该检测方法具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，不仅可使用目前存在市场上的所有类型PCR仪器，而且能快速地对甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测，为生产提供可靠的保证产品质量的方法。

技术领域

本发明属于昆虫病毒生物农药检测技术领域，具体涉及一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用。

背景技术

甜菜夜蛾(Beet armyworm)学名Spodoptera exigua Hiibner，俗称白菜褐夜蛾，隶属于鳞翅目、夜蛾科，是一种世界性分布、间歇性大发生的以危害蔬菜为主的杂食性害虫，对大葱、甘蓝、大白菜、芹菜、菜花、胡萝卜、芦笋、蕹菜、苋菜、辣椒、豇豆、花椰菜、茄子、芥兰、番茄、菜心、小白菜、青花菜、菠菜、萝卜等蔬菜都有危害。

甜菜夜蛾的发生规律、危害特点如下：初龄幼虫在叶背群集吐丝结网，食量小；3龄后，分散为害，食量大增，昼伏夜出，危害叶片成孔缺刻，严重时，可吃光叶肉，仅留叶脉，甚至剥食茎杆皮层。幼虫可成群迁飞，稍受震扰吐丝落地，有假死性；3～4龄后，白天潜于植株下部或土缝，傍晚移出取食为害；一年发生6～8代，7～8月发生多，高温、干旱年份更多，常和斜纹夜蛾混发，对叶菜类蔬菜威胁甚大。近年来，随着全球气候变暖和其它因素的影响，甜菜夜蛾的发生和危害呈逐年加重的趋势。

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)为杆状病毒科核型多角体病毒属病毒，形态为四边形到近似圆形，单个多角体内包埋多个病毒粒子，单个病毒粒子直径约为1.32nm，多角体病毒大小33.2～63.2nm×153～285nm，病毒核酸为双链环状DNA，MW：208×10⁷d，基因组大小135.6kb。

甜菜夜蛾核型多角体病毒是一种新型活体病毒杀虫剂，其杀虫机理是病毒经害虫取食后直接作用于害虫幼虫的脂肪体和中肠细胞核，并迅速复制，导致幼虫染病死亡；甜菜夜蛾幼虫感染病毒后，很快体色由青绿色逐渐变为黄绿色，最后变为灰白色，体节肿胀，食欲不振，直至死亡；死亡后表皮脆弱，容易液化。该病毒通过病虫粪便及死虫感染其他健康甜菜夜蛾，在田间引起“瘟疫”，导致大量幼虫死亡，该病毒专一性强，只对靶标害虫有效，不影响害虫的天敌，不污染环境，持效期长，是防治目标害虫的主要生物制剂之一，且安全环保，不杀伤害虫天敌，如草蛉、瓢虫、马蜂等，从而达到长期有效控制害虫种群增长的目的，持效期长达10～30天。

随着甜菜夜蛾规模化饲养技术的发展，病毒制剂的成熟，SeNPV杀虫剂的产业化和田间应用推广的不断发展，需要有更快更简单的方法对其有效成分甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，该方法具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、对硬件要求低等优势，不仅可使用目前存在市场上的所有类型PCR仪器，而且能快速地对甜菜夜蛾核型多角体病毒进行定性定量检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案是提供了一种甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，包括如下步骤：

1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；

2)将纯化后的部分病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；

3)甜菜夜蛾核型多角体病毒定性确认后，将纯化后的剩余病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。