[发明专利]甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法及应用

权利要求书

1.甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)采用沉降法与差速离心法结合，或沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合的方法对病毒粒子纯化；

2)将纯化后的部分病毒粒子采用酶联免疫法或PCR特异引物法对病毒粒子进行定性鉴别；

3)甜菜夜蛾核型多角体病毒定性确认后，将纯化后的剩余病毒粒子制成一定浓度的病毒悬液，采用电子显微镜计数法或显微镜计数法对病毒粒子的含量进行定量测定。

2.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中沉降法与差速离心法结合对病毒粒子纯化的过程：将感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死虫磨碎后加入等量的水，用双层纱布过滤后收集滤液，将滤液放入离心机在4℃、500～1500r/min条件下离心5～10min，再收集上清液在4℃、4000～8000r/min离心10～40min，收集沉淀，然后加水溶解沉淀，重复离心3～7次，以肉眼看不到杂质为准，即得纯化的病毒粒子。

3.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤1)中沉降法、差速离心法和密度梯度离心法相结合对病毒粒子纯化的过程：收集人工感染甜菜夜蛾核型多角体病毒的病死幼虫，称重后捣碎，在虫体中按质量比1：30～1：50加入磷酸盐缓冲溶液，纱布过滤，滤液经1500～4000r/min差速离心3～7次得到纯净的多角体粗制品，再将多角体病毒粗制品经质量分数为45～70％蔗糖密度梯度离心，取出病毒带，洗去蔗糖得纯净的多角体，再用质量分数45～70％蔗糖梯度在离心力41000g，温度4℃条件下超速离心2h，即得纯化的病毒粒子。

4.如权利要求1所述的甜菜夜蛾核型多角体病毒的定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤2)中酶联免疫法对病毒粒子定性鉴别的过程包括如下步骤：

a)抗血清的制备

称取纯化的病毒60mg用无菌生理盐水配成6mL病毒悬浮液，免疫雄性家兔，选用体重2.5kg的健康雄性家兔，进行静脉注射5次，剂量分别为2mg/次、4mg/次、8mg/次、16mg/次、25mg/次，每次间隔4d，末次注射一周后，杀兔采血，凝血后采集血清，加叠氮钠防腐，终浓度为1％，经对流免疫电泳和琼脂双扩散试验鉴定，并测定凝集效价；

b)抗原：病毒标样稀释液SeNPV 1.0×10³PIB/mL，1.0×10²PIB/mL，待检水悬浮液，稀释成1000倍，10000倍；

c)辣根过氧化物酶标记家兔抗SeNPV的制备

采用饱和硫酸铵沉淀透析法提取IgG，以分光光度计测定IgG含量，并测其凝集效价，然后用辣根过氧化物酶按二步法制备酶标IgG，测定酶和IgG的结合量，算出酶与IgG的克分子比，用琼脂双扩散试验和对流免疫电泳鉴定酶标IgG，在形成单一沉淀线后加酶底物邻苯二胺进行显色观察辣根过氧化物酶的IgG的结合程度；

d)ELISA检测

先取上述步骤a)制备的特异性抗血清吸附于固相载体，聚苯乙烯微量滴定板作固相载体；然后，取含有抗原的待检液，与致敏的固相载体温育后清洗，同时采用步骤b)病毒标样稀释液进行对照；再加入步骤c)辣根过氧化物酶标记的特异性抗体，温育后清洗；最后，加入新配制的邻苯二胺，室温下反应30min，滴硫酸溶液50μL，终止反应，出现黄色为阳性，则待检测样品为甜菜夜蛾核型多角体病毒。