[发明专利]一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种产β‑羟基‑β‑甲基丁酸工程菌的构建方法，包括下述步骤：以解脂耶氏酵母为底盘细胞，对其基因组中参与脂肪酸降解代谢的pox2、pox3、hbd、hcd和faa1共5个基因进行中断失活处理，得到基因剪切菌株；将黏细菌来源的LiuC、AibA和AibB基因、以及大肠杆菌来源的TesB基因整合入所述基因剪切菌株的基因组，得到产β‑羟基‑β‑甲基丁酸的工程菌。本发明构建的工程菌能够以葡萄糖为碳源发酵合成目标产物HMB，产量最高可达10g/L。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法，具体涉及一种用于生产β-羟基-β-甲基丁酸的解脂耶氏酵母菌的构建方法。

背景技术

β-羟基-β-甲基丁酸(3-Hydroxy-3-methylbutyrate Hydrate，HMB)是无色晶体，分子式为C₅H₁₀O₃，结构式为：

HMB的钙盐是一种营养补剂，可以在运动员耐力训练中防止肌肉损伤、肌蛋白断裂，也可作为减肥食品的有效成分；可促进动物生长、减少脂肪、增加瘦肉，保证动物健康。该化合物在1995年通过美国GRAS认证，推荐使用量≤3g/天，市场潜力巨大。

在人和动物体内的天然代谢途径中，β-羟基-β-甲基丁酸可经由支链氨基酸代谢途径中的亮氨酸(leucine)降解的中间产物α-KIC(α-ketosiocaproate)生成(Miyazaki,T.,A.Honda,T.Ikegami,J.Iwamoto,T.Monma,T.Hirayama,Y.Saito,K.Yamashita andY.Matsuzaki.Simultaneous quantification of salivary 3-hydroxybutyrate,3-hydroxyisobutyrate,3-hydroxy-3-methylbutyrate,and 2-hydroxybutyrate aspossible markers of amino acid and fatty acid catabolic pathways by LC–ESI–MS/MS.SpringerPlus.2015,4(1):494.)。目前HMB主要依赖化学合成法进行制备，例如主要是以次氯酸钠、二丙酮醇、盐酸、乙酸乙酯、乙醇、氢氧化钙为反应原料，经过氧化合成、酸化、萃取、中和反应、离心、干燥等步骤制得。但是，化学合成法存在着有机溶剂、腐蚀性酸等试剂使用量大、废料污染严重等无法克服的缺陷，使得化学合成法受到环境保护政策的严重管控和限制，承受着巨大的环保压力。

目前，人们普遍认为天然或生物来源的化合物更安全，对于药品、食品、化妆品成分的来源越来越追求“天然化”。出于市场推广目的，药品、食品、化妆品生产商都更乐意使用生物来源的产品来替代化学方法合成出来的相同物质。HMB作为广泛使用的天然化合物，寻找一种绿色环保的生物方法替代化学方法来生产已成为一种研究热点。

近些年来，生物合成法日益受到业内青睐。目前研究的HMB生物法主要是利用Galactomyces reessii菌体细胞发酵、同步流加底物β-甲基丁酸进行生物催化来制备HMB(Lee,I.Y.and J.P.N.Rosazza.Archives of Microbiology.1998,169(3):257-262.Lee,I.Y.,S.L.Nissen and J.P.Rosazza.Applied and Environmental Microbiology.1997,63(11):4191-4195.)。但是，该方法存在反应产物组分复杂、后期分离纯化困难等问题。

目前还未有直接通过天然真菌或真菌工程菌进行发酵来生产HMB的报道，这成为本发明要实现的目标。

发明内容