[发明专利]一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其通过包括下述步骤的方法构建：

1)以解脂耶氏酵母为底盘细胞，对其基因组中参与脂肪酸降解代谢的pox2、pox3、hbd、hcd和faa1共5个基因进行中断失活处理，得到基因剪切菌株；

2)将黏细菌来源的LiuC、AibA和AibB基因、以及大肠杆菌来源的TesB基因整合入步骤1)中得到的基因剪切菌株基因组，其中基因LiuC的碱基序列为SEQ ID NO:1，基因AibA的碱基序列为SEQ ID NO:2，基因AibB的碱基序列为SEQ ID NO:3，基因TesB的碱基序列为SEQID NO:4；

3)挑取阳性转化子，对基因组进行PCR验证，得到产β-羟基-β-甲基丁酸的工程菌。

2.如权利要求1所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，步骤1)中的5个基因中断失活处理是通过利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑而完成的。

3.如权利要求1所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，步骤2)中的基因整合是通过将LiuC、AibA、AibB和TesB基因表达模块共转化步骤1)中得到的基因剪切菌株，利用细胞自身的DNA组装重组能力来实现的。

4.如权利要求1所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，步骤2)是以URA3基因作为筛选标记，以酵母染色体rDNA位点作为整合位点，将各基因表达模块整合组装在染色体上。

5.如权利要求4所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，所述基因表达模块包括：LiuC基因表达模块rDNAu-TEF1p-LiuC-xpr2t，含有启动子TEF1p、LiuC基因、终止子Xpr2t；AibA基因表达模块EXP1p-AibA-mig1t，含有启动子EXP1p、AibA基因、终止子Mig1t；AibB基因表达模块GPDp-AibB-lip2t，含有启动子GPDp、AibB基因、终止子Lip2t；TesB基因表达模块GPM1p-TesB-lip1t，含有启动子GPM1p、TesB基因、终止子Lip1t。

6.如权利要求4所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，所述基因表达模块还包括筛选标记URA3基因表达模块URA3-rDNAd。

7.如权利要求1所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，所述解脂耶氏酵母底盘细胞是Yarrowia lipolytica ATCC MYA-2613。

8.如权利要求2所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，所述pox2基因的中断失活处理可以是利用CRISPR/Cas9系统对YALI0F10857g基因进行剪切；所述pox3基因的中断失活处理可以是利用CRISPR/Cas9系统对YALI0D24750g基因进行剪切；所述hbd基因的中断失活处理可以是利用CRISPR/Cas9系统对YALI0C08811g基因进行剪切；所述hcd基因的中断失活处理可以是利用CRISPR/Cas9系统对YALI0C07414g基因进行剪切；所述faa1基因的中断失活处理可以是利用CRISPR/Cas9系统对YALI0D17864g基因进行剪切。

9.如权利要求4所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌，其特征在于，所述基因表达模块在染色体上的整合组装顺序为：从上游至下游依次是LiuC基因表达模块、AibA基因表达模块、AibB基因表达模块、TesB基因表达模块、URA3基因表达模块。

10.如权利要求1中所述的产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌在发酵法生产β-羟基-β-甲基丁酸中的用途。