[发明专利]大黄鱼抗菌肽Hepcidin-like及其制备方法与应用

说明书

大黄鱼抗菌肽Hepcidin‑like及其制备方法与应用，涉及抗菌肽。提供大黄鱼抗菌肽Hepcidin‑like基因的编码序列、氨基酸序列、制备方法和应用。给出具有序列表中序列1的开放阅读框和系列表中序列2的氨基酸序列；Lc‑HepL的ORF克隆；构建表达载体；重组表达载体pET‑32a‑HepL在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pLys中转化宿主细胞并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化得到的表达产物，得到重组蛋白Lc‑HepL。Lc‑HepL对刺激隐核虫具有抑杀活性，在制备抗虫药物和作为水产养殖业中防治病害的饲料添加剂中应用。

技术领域

本发明涉及抗菌肽，尤其是涉及大黄鱼抗菌肽Hepcidin-like及其制备方法与应用。

背景技术

抗菌肽是生物防御系统产生的一类具有对抗外源性病原体活性的肽类物^[1]，具有广谱抑杀菌活性，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、寄生虫、病毒和肿瘤细胞^[2]。因此，抗菌肽在医药、农业、畜牧业等多个领域都具有重要的潜在应用前景。

Hepcidin是一类具有β-折叠结构的抗菌肽，2002年首次从杂交斑纹鲈鱼的鳃中分离获得了一个Hepcidin的成熟肽片段，具有广谱抗菌活性^[3]。迄今，已从多种鱼类中分离克隆到Hepcidin基因，包括虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)^[4]、黑鲷(AcanthopagrusschlegeliiB)^[5]、大西洋马哈鱼(Salmo salar)^[6]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)^[7]。鱼类Hepcidin的研究，主要集中在与细菌感染和炎症相关的研究上，更关注其在先天性免疫系统中的作用^[3,7-8]。大黄鱼Hepcidin为阳离子抗菌肽，由信号肽、前导肽和成熟肽组成，具有广谱抑杀菌活性，对NaCl和MgCl₂具有一定的耐受能力^[7]。黑鲷Hepcidin-like参与了抗菌的免疫反应^[5]。

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是能够感染绝大部分海水鱼类的体外寄生的原生动物，传播性极强，已被列为农业部二类动物疫病，他所引发的“海水白点病”和继发行细菌感染给海水鱼养殖带来了巨大的经济损失，其能导致大黄鱼75％的死亡率^[9]。因此由刺激隐核虫引起的海水白点病的防止是急亟需解决。化学类药物和抗生素的使用不仅造成养殖环境的污染，最重要的是抗生素的残留。利用鱼类的自身免疫系统来抵抗寄生虫的感染成为了研究热点，也是一种健康安全的防控方式。已有研究发现不少的抗菌肽具有很强的抗虫功能，大黄鱼piscidin-like既有广谱的抗菌活性，又是一种很强的抗虫肽^[10]；眼斑拟石首鱼Sciaenopsocellatuspiscidin-like仅具有较强的抗虫活性^[11]。从丰富的海洋动物抗虫活性物质资源库中筛选具有特殊杀虫效果的抗虫肽，进行抗虫相关产品开发或者提高鱼类自身抗虫水平，具有巨大的科学价值、市场需求和发展前景。

体外重组表达大黄鱼Hepcidin-like不仅在研究大黄鱼抗刺激隐核虫的免疫防御机制方面具有重要意义，而且为研发抗病药物提供参考依据。

参考文献：

[1]谭显胜,李巍巍,王志明,袁哲明.抗菌肽的研究进展[J].现代生物医学进展.2009，9:3153-3156.

[2]Brogden KA.Antimicrobial peptides:pore formers or metabolicinhibitors in bacteria？[J].Nat.Rev.Microbiol.2005,3:238-250.