[发明专利]一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法

说明书

本发明公开了一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法及应用，属于基因工程技术领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为表达宿主，通过在目的蛋白N端编码基因前添加通过特定方法设计的氨基酸序列，并在质粒中游离表达，使重组枯草芽孢杆菌目的蛋白表达量提高至改造前的397倍，降低至改造前的1.94％。这为枯草芽孢杆菌基因蛋白高效表达和基因工程改造奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性菌的模型微生物，用于孢子形成机制和代谢调节的实验室研究，在自然界广泛分布，包括土壤表面，水环境和动物胃。它是一种非致病微生物，不含内毒素，并且通常被美国食品和药物管理局(FDA)认可为安全(GRAS)食品级微生物。此外，枯草芽孢杆菌具有许多优点，包括：细胞生长快，培养时间短，培养要求低，分泌蛋白质能力强，广泛用于工业酶生产，高附加值产品的生物合成。然而，调控元件文库的构建仍然落后于其他重要的模式生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

为了调节枯草芽孢杆菌中的基因表达，目前应用的枯草芽孢杆菌的标准表达元件主要包括启动子，终止子，RBS序列，SPACER等。此外，已经构建了与枯草芽孢杆菌蛋白质表达相关的越来越多的遗传工具箱。然而，当前表达元件的应用具有各自的缺点，包括效果不明显、操作成本高等。此外，大多数标准元件侧重于转录水平的调节，翻译水平控制工具和组件较少，而翻译水平对基因表达也有很大影响。因此，在枯草芽孢杆菌中开发易于使用的表达调控元件十分重要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，所述方法是对目的蛋白的N端序列进行改造，将改造后的目的蛋白转入枯草芽孢杆菌中进行表达，所述N端序列元件是目的蛋白N端第1-15个氨基酸的编码序列，所述改造的方法包括以下任意一种或几种：

(1)将目的蛋白N端序列中的丝氨酸(S)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、精氨酸(R)列为第一候选位点；当N端第2位非天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、或谷氨酸(E)时，将N端第2位列为第二候选位点，然后将第一候选位点、第二候选位点替换为天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中的任意一种；替换时，满足下述(a)和(b)：

(a)当第一候选位点、第二候选位点的前一个氨基酸或后一个氨基酸是天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中的任意一种氨基酸时，将该候选位点替换成与其前一个氨基酸或后一个氨基酸相同的氨基酸，但是，若替换后，从该候选位点的前三位至后三位的7个氨基酸中包含了连续4个及以上的由天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中任意一种或多种组成的氨基酸，则将该候选位点替换为谷氨酰胺(Q)或异亮氨酸(I)；

(b)在优先满足(a)的前提下，替换成天冬酰胺的候选位点的数量与替换成赖氨酸的候选位点的数量、替换成谷氨酸的候选位点的数量中的任意一个的差值不超过2；

(2)将目的蛋白N端序列中的天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺所在位点列为第三候选位点，然后将第三候选位点按顺序依次替换成丝氨酸、色氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸。

在本发明的一种实施方式中，(1)中替换后的天冬酰胺使用密码子AAC或AAT、赖氨酸使用密码子AAA、谷氨酸使用密码子GAA、谷氨酰胺使用密码子CAA。

在本发明的一种实施方式中，(2)中替换后的丝氨酸使用密码子TCC或TCT、色氨酸使用密码子TGG、天冬氨酸使用密码子GAT、半胱氨酸使用密码子TGT。

在本发明的一种实施方式中，(a)(b)(c)属于提高枯草芽孢杆菌蛋白表达的N端序列元件改造方法，(d)属于降低枯草芽孢杆菌蛋白表达的N端序列元件改造方法。