[发明专利]一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法

权利要求书

1.一种调控枯草芽孢杆菌中目的蛋白表达的方法，其特征在于，对目的蛋白的N端序列进行改造，将改造后的目的蛋白转入枯草芽孢杆菌中进行表达，所述N端序列元件是目的蛋白N端第1-15个氨基酸的编码序列，所述改造的方法包括以下任意一种或几种：

(1)将目的蛋白N端序列中的丝氨酸(S)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、组氨酸(H)、精氨酸(R)列为第一候选位点；当N端第2位非天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、或谷氨酸(E)时，将N端第2位列为第二候选位点，然后将第一候选位点、第二候选位点替换为天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中的任意一种；替换时，满足下述(a)和(b)：

(a)当第一候选位点、第二候选位点的前一个氨基酸或后一个氨基酸是天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中的任意一种氨基酸时，将该候选位点替换成与其前一个氨基酸或后一个氨基酸相同的氨基酸，但是，若替换后，从该候选位点的前三位至后三位的7个氨基酸中包含了连续4个及以上的由天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸中任意一种或多种组成的氨基酸，则将该候选位点替换为谷氨酰胺(Q)或异亮氨酸(I)；

(b)在优先满足(a)的前提下，替换成天冬酰胺的候选位点的数量与替换成赖氨酸的候选位点的数量、替换成谷氨酸的候选位点的数量中的任意一个的差值不超过2；

(2)将目的蛋白N端序列中的天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺所在位点列为第三候选位点，然后将第三候选位点按顺序依次替换成丝氨酸、色氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中替换后的天冬酰胺使用密码子AAC或AAT、赖氨酸使用密码子AAA、谷氨酸使用密码子GAA、谷氨酰胺使用密码子CAA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中替换后的丝氨酸使用密码子TCC或TCT、色氨酸使用密码子TGG、天冬氨酸使用密码子GAT、半胱氨酸使用密码子TGT。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)属于提高枯草芽孢杆菌蛋白表达的N端序列元件改造方法。

5.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，(2)属于降低枯草芽孢杆菌蛋白表达的N端序列元件改造方法。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造后的目的蛋白的N端序列包括SEQID NO.15～35。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括Bacillussubtilis168。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白包括酶蛋白、非酶蛋白。

9.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，以Bacillus subtilis 168为宿主，以pP43NMK为表达载体，表达权利要求6所述改造后的目的蛋白。

10.权利要求9所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵产目的蛋白中的应用。