[发明专利]坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法

说明书

本发明公开了一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌。所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于D‑乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。本发明得到的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，可通过大肠杆菌原核表达和真核表达系统获得，并制备纯酶或粗酶液或用于生物催化反应。利用制得的乳酸脱氢酶，在磷酸盐缓冲液体系中，在25℃条件下，可将丙酮酸转化为乳酸，其转化率达到了93%以上。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。

背景技术

乳酸脱氢酶(LDH)，广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内，是以NADH为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成L-乳酸和D-乳酸，是乳酸菌合成乳酸的关键酶。乳酸脱氢酶在生物制化工领域可用于苯乳酸等产品制备，临床上可作为心肌疾病、肝病等的诊断指标，同时也可作为食品添加剂用于发酵奶制品如干酪、腌渍品、糖果制品和饮料的生产。除此之外，乳酸脱氢酶在体外诊断领域有着广泛的应用，是丙氨酸氨基转移酶试剂盒等体外诊断试剂的主要原料，主要应用于生化研究、白血病和心肌梗塞等疾病的诊断。因此，开发新型、具有高催化活性的乳酸脱氢酶的具有重要的实际意义和良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。

为了实现上述目的，本发明所设计的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。

所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌(Weissella kandleri)。

所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于D-乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。

本发明还公开了一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取

本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；

步骤二、工程表达菌株的构建

将坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Wk-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；

步骤三、乳酸脱氢酶Wk-LDH的诱导表达

挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50ml LB培养液、含有50μg/ml卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；

步骤四、乳酸脱氢酶Wk-LDH粗酶液的制备

取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1M PBS缓冲液洗涤1次，40ml 0.1M磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；

步骤五、乳酸脱氢酶Wk-LDH的纯化