[发明专利]坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法在审
| 申请号： | 201811177782.0 | 申请日： | 2018-10-10 |
| 公开（公告）号： | CN109182285A | 公开（公告）日： | 2019-01-11 |
| 发明（设计）人： | 梅义武;吴志革;刘兴;叶佳颖;叶远帆;李松浩 | 申请（专利权）人： | 浙江卓运生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/04 | 分类号： | C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12P7/56 |
| 代理公司： | 宁波市鄞州金源通汇专利事务所(普通合伙) 33236 | 代理人： | 龚丹宇 |
| 地址： | 315175 浙江省宁波市海曙区高*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 乳酸脱氢酶 乳杆菌 乳酸 制备 体外诊断试剂盒 磷酸盐缓冲液 生物催化反应 真核表达系统 大肠杆菌 丙酮酸转化 蛋白质序列 基因序列 原核表达 粗酶液 纯酶 可用 酮酸 应用 转化 开发 | ||
1.一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的应用，其特征在于：所述乳酸脱氢酶用于D-乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；
步骤二、工程表达菌株的构建
将坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Wk-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；
步骤三、乳酸脱氢酶Wk-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2 m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50ml LB培养液、含有50μg/ml卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；
步骤四、乳酸脱氢酶Wk-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1MPBS缓冲液洗涤1次，40ml 0.1M 磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
步骤五、乳酸脱氢酶Wk-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于buffer A缓冲液中，高压破胞，然后 4℃ 15,000 rpm 离心30 分钟，然后将上清加入到预先洗好Ni-NTA beads 中，4℃滚轴混合一个小时，将含有beads 的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液清洗3 次，然后用 Elution Buffer缓冲液洗脱蛋白。
6.根据权利要求5所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述buffer A缓冲液包括50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4， 300 mM NaCl；所述bufferB缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，5mM Imidazole；所述Elution Buffer缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，150mM Imidazole。
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