[发明专利]一种基于基因组二代测序的载体插入位置检测方法

说明书

本发明公开了一种基于基因组二代测序的载体插入位置检测方法。所述方法是将植物突变体进行全基因组测序后使用序列比对软件按照特定方法进行序列分析得到载体插入位置。本发明具有如下优点：(1)利用服务器进行分析，处理速度快，每个样品约半小时即可完成，相对于TAIL‑PCR方法的至少3天，分析时间大大缩短。(2)结果准确，利用测序质量较高的reads比对，结果特异，而TAIL‑PCR方法原理就是利用兼并不特异引物进行PCR扩增，存在一定的假阳性。

技术领域

本发明涉及一种基于基因组二代测序的载体插入位置检测方法。

背景技术

载体插入突变在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用，广泛应用于植物基因组功能分析，是分析新基因，研究基因功能的有效工具。现在市面上有T-DNA插入库及过表达载体库等。了解载体插入的位置是载体插入库首先要解决的问题，检测载体是否插入到基因中造成突变等等，其中TAIL-PCR是现在比较主流的载体插入位置检测方法，TAIL-PCR即交错式热不对称PCR，是一种染色体步移技术。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环，利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段，所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL-PCR的产物可以直接用来测序，但是好多情况下测的并不是很好，比较好的方法是将PCR产物进行TA克隆，然后进行测序，克隆中存在假阳性。TAIL-PCR，及构建克隆测序，费时费力。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于基因组二代测序的载体插入位置检测方法。

本发明首先提供了一种检测植物突变体基因组中载体插入位置的方法，包括如下步骤(1)和步骤(2)：

(1)对待测突变体进行全基因组测序；

(2)完成步骤(1)后，对测序结果进行如下步骤(a)-(d)：

(a)将所有reads的完整序列从5’-3’方向切除2/3长度的序列，将剩余的部分比对到载体，筛选能100％比对到载体上的reads；

(b)将步骤(a)筛选得到的所有reads的完整序列从3’-5’方向切除2/3长度的序列，将剩余的部分比对到植物参考基因组，筛选能100％比对到植物参考基因组上的reads，reads所对应的位置为插入位置；

(c)将步骤(b)筛选得到的所有reads的完整序列分别比对到载体和植物参考基因组，去除能够100％完全比对到载体和植物参考基因组上的reads，其余reads保留；

(d)完成步骤(c)后，对保留的reads位置进行汇总，确定插入位置；

所述植物参考基因组为所述突变体植株属于同一种的植物的参考基因组；

所述植物突变体为载体插入突变体。

所述基因组测序具体可采用二代测序。所述二代测序具体可为Roch公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术。

所述步骤(2)使用序列比对软件实现；所述序列比对软件为bowtie2。

本发明还保护一种用于检测植物突变体基因组中载体插入位置的系统，包括全基因组测序仪器、序列比对软件和记载有以上任一所述方法的说明书；所述植物突变体为载体插入突变体。所述序列比对软件具体可为bowtie2。

以上任一所述突变体具体可为从现有突变体库购买载体插入突变体，或采用将适当载体导入原始植株的方法筛选得到理想的突变体。

本发明还保护以上任一所述的方法在植物突变体基因组分析中的应用。

本发明还保护以上任一所述系统在植物突变体基因组分析中的应用。