[发明专利]一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种OX40基因修饰人源化动物模型的制备方法，该方法利用CRIPSR/Cas9技术，通过构建打靶载体，利用同源重组的方式将小鼠OX40基因的外显子1－7替换为人OX40基因片段，从而制备出基因修饰人源化小鼠，该小鼠能正常表达含有人OX40蛋白功能域的蛋白，可以作为OX40信号机理研究，调节剂筛选，毒理研究的动物模型，这对于研究OX40基因的功能，以及新药研发具有重要的应用高价值。

技术领域

本发明涉及动物模型领域，尤其涉及一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用。

背景技术

人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。

研究人类复杂疾病的发病机制，筛选有效药物，需要理想的动物模型来进行大量的体内试验。小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大、小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，是进行一些人类疾病研究的方法。

OX40，别名TNFRSF4(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 4)或者CD134，是TNFR/TNF超家族的一个极其重要的受体分子。OX40在CD4+和CD8+T细胞免疫应答中起重要作用，其影响T细胞依赖的B细胞的增殖和分化，此外OX40还促进凋亡抑制剂BCL2and BCL2lL1/BCL2-XL的表达，从而抑制细胞凋亡。

临床研究表明，OX40的激动可导致免疫效应和记忆功能的刺激，减少免疫抑制调节性T细胞(多出现在肿瘤中)。OX40激动剂在癌症中的作用已日益受到重视，目前多种激动剂处于研发阶段或已开始在临床试验中用于癌症治疗。

为了使临床前期的试验更有效并使治疗失败最小化，提供一种OX40基因人源化的改造动物模型非常重要，目前尚缺乏真正意义上的OX40基因人源化小鼠。虽然有文献报道制备人源化OX40基因的动物模型，但是其动物模型中OX40基因并未实现全部外显子的人源化，仅仅制备了第1号外显子的部分序列、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子的部分序列来自人源的OX40基因动物模型。这种动物模型还是未做到OX40基因及其表达产物尽可能与人相同的效果。

我们构建了针对mouse OX40基因的gRNA和携带human OX40片段的Donor vector，利用CRISPR/Cas9技术和囊胚注射技术，将mouse OX40基因的E1-7coding region替换为human OX40片段。在替换的同时保留了mouse OX40基因的UTR区域，保证了human OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。同时，我们对于CRISPR/Cas9技术中用到的各个原件包括gRNA等进行了充分的优化和调整，保证采用该技术制备人源化OX40基因动物模型的成功率和准确率。

发明内容

本发明提供了一种人源化小鼠OX40基因的DNA序列，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制。

还提供了包含权利要求1所述DNA序列的载体。

提供所述DNA序列或所述载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。

本发明还提供一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；