[发明专利]一种OX40基因修饰人源化动物模型的构建方法和应用

权利要求书

1.一种包含人源化小鼠OX40基因的DNA序列的载体，其特征在于，该DNA序列编码的蛋白含有人OX40蛋白的功能域，其是将小鼠OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人OX40片段，在替换的同时保留了小鼠OX40基因的UTR区域，保证人OX40表达受小鼠自身启动子和调控序列控制，所述载体的制备步骤如下：

①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、引物对SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；

②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；

③以pMD18-T vector为模板，利用引物对SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；

④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；

⑤用I-CeuI酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。

2.权利要求1所述的载体在制备OX40基因修饰人源化的动物模型中的用途。

3.一种制备OX40基因修饰人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建表达针对鼠源OX40基因的sgRNA的质粒；其中针对鼠源OX40基因的sgRNA的序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO:2所示；

(2)将人源OX40基因的DNA序列、鼠源OX40基因的3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化OX40基因的载体；

(3)将步骤(1)所述质粒体外转录获得的sgRNA与步骤(2)的载体以及Cas9mRNA注射至鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产OX40基因修饰人源化鼠模型；

所述载体能够将鼠源OX40基因的外显子1－7的编码区替换为人源OX40的片段，在替换的同时保留鼠源OX40基因的UTR区域，保证人源OX40表达受鼠自身启动子和调控序列控制，所述载体的制备步骤如下：

①以小鼠基因组为模板，分别利用引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、引物对SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10进行PCR，得到特异的PCR条带，分别命名为H1、H3片段，H1为5’端同源臂，H3为3’端同源臂；

②以人源OX40BAC为模板，利用引物对SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为H2，H2为hOX40序列片段；

③以pMD18-T vector为模板，利用引物对SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行PCR，得到特异的PCR条带，片段命名为18T骨架；

④将H1、H2、H3、18T骨架共四个片段连接，构建质粒Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor；

⑤用I-CeuI酶切Human OX40-Cas9-KI-(S4-S8)donor，产物大小4284+2720bp，回收4284bp片段；酚:氯仿抽提，溶于Rnase free的水中，直接用于注射。

4.如权利要求3所述的方法，其中步骤(1)中构建表达sgRNA的质粒的过程如下：

1)BsaI线性化pUC57-gRNA-T7载体，并用CIAP去磷酸化；

2)退火：序列如SEQ ID NO：3和4的上下游引物、以及序列如SEQ ID NO：5和6的上下游引物分别稀释，退火；

3)加磷酸：退火产物进行加磷酸处理

4)连接：取加磷酸后的产物与线性化并去磷酸处理的pUC57-gDNA-T7进行连接，分别获得表达序列如SEQ ID NO：1所示的sgRNA的质粒1和序列如SEQ ID NO：2所示的sgRNA的质粒2。