[发明专利]一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法

说明书

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建含有重组质粒pET‑28a‑ydiI的大肠杆菌工程菌；(2)取含有重组质粒pET‑28a‑ydiI的大肠杆菌工程菌，制备诱导细胞；(3)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入10‑羟基癸酸，制备10‑羟基‑2‑癸烯酸；本发明首次公开了利用基因工程改造的含有硫酯酶的阳性重组大肠杆菌，经过特殊诱导处理后，可以通过静息细胞发酵生产10‑羟基‑2‑癸烯酸，实现了10‑羟基‑2‑癸烯酸的大量生物合成。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C10H18O3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：

鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。10-HDA的结构式如下：

目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。

中国专利文献CN108265041A(申请号201810230833.5)公开了一种小分子硫酯酶的表达方法及应用，具体涉及一种小分子蛋白硫酯酶在大肠杆菌中的重组表达及其在生产一种10-羟基-2-癸烯酸中间产物反式-2-癸烯酸中的应用。该发明将大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI连接到含有sumo标签的pET-28a质粒上，转入大肠杆菌BL21(DE3)，利用重组大肠杆菌(含pET-28a-ydiI)，通过无细胞体系生产反式-2-癸烯酸。但利用生物发酵方法生产10-羟基-2-癸烯酸的相关技术未见报道。

静息细胞是一种处于休眠状态，不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，具有氧化和发酵能力，在适宜条件下可再恢复生长的处于特殊状态的细胞。静息细胞反应专一性强,可以提高底物转化率,不易染杂菌,可以减少产物对菌体生长整个细胞通过提供一个安全的细胞室和最佳的环境条件，使其具有较高的及酶合成的抑制。静息细胞为不能独立发挥作用的酶的生物催化提供了可能，此外，还可以保证酶的稳定性。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：

(1)构建含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌；

(2)取步骤(1)制得的含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌工程菌，接入含有抗生素的液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2时，降温至14～20℃适应0.5～2小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.5～0.8mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞；