[发明专利]通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法

说明书

本发明通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌‑枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pCBS为骨架构建一个基因过表达载体pCBS‑LPDegUR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组DegU基因的方法构建了一株高产bacillomycin D菌株fmbJdegU。经过高效液相色谱分析，确定过表达DegU基因的菌株产bacillomycin D的能力大幅度提高。

一、技术领域

本发明涉及通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

作为促进植物生长的根际微生物，芽孢杆菌属在可持续农业方面显示出光明的前景。它们不仅能分泌促进植物生长的物质，还能产生许多具有抗菌活性的次级代谢产物。

CGMCC No.0943枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ,是一种可以分泌bacillomycin D、surfactin、fengycin等抗菌脂肽物质的芽孢杆菌。其中，bacillomycin D属于iturin家族成员，是通过非核糖体多肽合成酶催化形成的由一个14-17个C的β-氨基脂肪酸和7个氨基酸缩合而成的环状脂肽结构。它对黄曲霉、赭曲霉以及禾谷镰刀菌等具有很强的抑制作用。其中，真菌毒素是霉变食品的最大危害，严重威胁人类健康。而化学合成防腐剂具有食品安全的风险，研究和开发新的天然安全的农产品保鲜剂在保障粮食和食品安全以及防治真菌污染等方面具有重要的意义。但实际中，其并未在可持续农业以及环境保护中广泛应用，究其原因，是由于它的生产成本高，因此，提高其产量便成为降低其生产成本的关键问题。

目前，国内外研究成果显示，提高bacillomycin D产量的方法主要是筛选优良菌株，以及优化其发酵条件，而很少采用分子生物学手段对菌种进行改良的方法来提高bacillomycin D产量。但随着对抗菌肽合成分泌机制研究的日益深入，已经逐渐开始采用分子生物学技术，通过改造其合成分泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良，从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。

DegU基因(Gene ID:5459660)的表达产物是双组份调控系统中的DegU调控蛋白。它直接作用于bacillomycin D的启动子区域，在bacillomycin D的形成中发挥着重要的作用，相关研究表明，DegU调控蛋白对于抗菌物质bacillomycin D的合成具有一定的促进作用。

本方法首先以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体pCBS为骨架构建一个基因过表达载体pCBS-LPDegUR，利用同源重组原理，通过双交换过程在淀粉酶位点敲入枯草芽孢杆菌fmbJ基因组degU基因的方法构建了一株高产bacillomycin D菌株fmbJdegU。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是利用分子生物学技术，构建degU基因过表达载体，经过电转化通过同源重组在淀粉酶位点将枯草芽孢杆菌fmbJ基因组中degU基因敲入，从而构建一种高产抗菌肽bacillomycin D的枯草芽孢杆菌菌株fmbJdegU的方法。

技术方案

1、通过过表达degU基因提高抗真菌肽bacillomycin D产量的方法，其特征在于：

(1)degU基因过表达载体pCBS-LPDegUR的构建