[发明专利]一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法

说明书

本发明公开了一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，包括如下步骤：1)采用改良酚‑氯仿法分别提取棕鳟和亚东鲑组织的基因组DNA；2)设计ITS1序列的引物；3)以两种鱼的DNA为模板，进行PCR扩增；4)PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收后与pMD18‑T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，对每个个体挑取单克隆进行菌液测序；5)序列比对。有益效果为：本发明分子生物学方法科学有效、简单快捷、准确可行，特异性强、可信度高，不用处死棕鳟和亚东鲑，能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法。

技术背景

棕鳟(Salmo trutta fraio Linnaeus)又名河鳟、河鲑等，隶属于鲑科、鲑亚科、鲑属，原产于欧洲、非洲北部和中亚一些地区，属于冷水性经济鱼类，具有较高的经济价值和营养价值。19世纪由英国人从欧洲引种移植后，目前我国仅栖息于西藏日喀则地区亚东县海拔约3000m的亚东河，为我国西藏高海拔地区的重要珍稀经济鱼类，1992年被西藏自治区列为二级水生保护动物。新疆维吾尔自治区具有丰富的冷水资源，为了充分利用丰富冷水资源，培育优质冷水鱼新品种，新疆有关科研院所2009年从西藏亚东地区引进少量亚东鲑进行试验性养殖，此后2011年起又连续多年从巴基斯坦引进棕鳟发眼卵进行孵化和养殖试验，并获得了成功。

有研究认为亚东鲑为棕鳟的同物异名，也有认为亚东鲑是棕鳟的一个亚种，二者仅从外部形态上几乎难以分辨。准确的物种鉴定是开展人工繁殖的前提和基础，为了准确、快速对二者进行鉴别，防止养殖过程中亲本和鱼苗的混杂，有必要进行相关技术的研发。核糖体DNA转录间隔区1(internal transcribed spacer，ITS1)在进化过程中表现出高度的保守性，成为研究生命起源和早期生物进化高级阶元系统发育的最主要的分子标记，是介于5.8S rDNA和28S rDNA基因之间的一段非编码区序列，由于承受的选择压力较小、相对变化较大，适合物种及种群水平的系统发生研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种科学有效、简单快捷、准确可行，特异性强、可信度高，不用处死棕鳟和亚东鲑，能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点的鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：包括如下步骤：

采用改良酚-氯仿法分别提取棕鳟和亚东鲑组织的基因组DNA；

设计ITS1序列的引物；

以两种鱼的DNA为模板，进行PCR扩增；

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用天根回收试剂盒纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，对每个个体挑取单克隆进行菌液测序，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的PCR片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对PCR片段进行克隆扩增；

序列比对。ITS1基因在进化过程中表现出高度的保守性，由于承受的选择压力较小、相对变化较大，适合物种及种群水平的系统发生研究，本发明通过分子克隆技术，通过选择ITS1基因、扩增并测序比对了两种鱼类ITS1序列，查明变异位点差异来鉴别棕鳟和亚东鲑，为二者提供了一种科学有效、简单快捷、准确可行的分子生物学鉴定方法，具有特异性强、可信度高的优势，同时也为其种质资源保护和开发利用提供保障。