[发明专利]一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法

权利要求书

1.一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)采用改良酚-氯仿法分别提取棕鳟和亚东鲑组织的基因组DNA；

2)设计ITS1序列的引物；

3)以两种鱼的DNA为模板，进行PCR扩增；

4)PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α，对每个个体挑取单克隆进行菌液测序；

5)序列比对。

2.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述改良酚-氯仿法用组织提取液含有10mM Tris-Cl、0.1M EDTA、0.32mM DTE、0.04mM BJ-BR、0.5％SDS；所述组织提取液的pH为7.8。

3.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述步骤1用棕鳟和亚东鲑组织分别取自尾鳍组织。

4.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述设计ITS1序列的引物的具体步骤为：从Genbank数据库中下载棕鳟和亚东鲑的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的5.8S rDNA和28S rDNA上设计扩增核糖体ITS1序列的引物。

5.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述ITS1序列的引物序列为：

Gits1F：5’-AAAAAGCTTCCGTAGGTGAACCTGCG-3’；

Gits1R：5’-AGCTTGCTGCGTTCTTCATCGA-3’。

6.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述步骤3中PCR扩增反应总体积50μL，其中10×buffer 5.0μL，Mg²⁺终浓度为2.0mM，2.5mM dNTP4μL，Taq聚合酶2units，10μM引物各2μL，1μgDNA模板2μL，加灭菌水至终体积50μL。

7.根据权利要求1所述的一种鉴别棕鳟和亚东鲑的分子生物学方法，其特征在于：所述步骤3中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，然后是35个循环，每个循环包括94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃再延伸10min。