[发明专利]一种通过环状单链探针制备长探针的方法及其在基因芯片生产中的应用

说明书

本发明公开了一种通过环状单链探针制备长探针的方法及其在基因芯片生产中的应用。本发明通过将探针和扩增接头连接成环，或是探针自身连接成环，得到环状单链探针；对环状单链探针扩增，得到直链单链的长探针。该方法具有如下优点：扩增所得探针长度极佳，可达10000nt以上；探针扩增长度与扩增时间近似线性关系，到批量操作时，同批次探针长度均一，杂交信号更均匀；扩增所得探针产量极高，约为直接连接法的几十倍，且省去反复磷酸化、连接反应流程，节省大量生物酶的使用和制备时间。因此，本发明特别适合在基因芯片生产中进行应用。

技术领域

本发明涉及一种探针的制备方法，特别涉及一种通过环状单链探针制备长探针的方法及其在基因芯片生产中的应用。

背景技术

基因芯片，又称DNA芯片，是基于DNA分子杂交原理制造的一种生物芯片。通过与一组已知序列的核酸探针杂交，进行核酸序列测定、定性和定量检测。固定于基片表面已知序列的靶核苷酸，称为探针。当溶液中带有荧光标记的核酸分子，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，可通过荧光信号的强度和位置确定检测核酸的序列和含量。基因芯片可同时对大量的核酸分子实现高效、快速、低成本的检测和分析。

基因芯片具有广泛的应用，包括疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等许多领域。帮助人类认识生命的起源、遗传、发育与进化过程，为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支持平台。

目前，基因芯片有两种主要类型，点样法和原位合成法。点样法是使用自动化微量点样装置将预先制备好的探针点印在玻璃板上，通过化学修饰的方法固定在对应的位置上。这种方法的点阵密度范围可从数百至几万，各个探针在表面的结合量也比较一致，是一种成本较低且订制灵活的方法。但这种方法的点阵密度较原位合成法仍有差距。原位合成法是应用微电子光刻技术与DNA化学合成技术，在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列。这种方法探针密度极高，可达十万级别，但订制成本极高，灵活性不及点样法。其次，采用每个探针分子通过一个化学键的方式与基材结合，所以也存在效率低，背景信号高的缺点。

因此，人们在制备芯片的时候，都希望用较低的成本得到灵敏度较高的芯片。国家发明专利“高特异性高灵敏度的基因芯片及其制备方法与应用”(CN 102168146 B)提供了一种基因芯片的制备方法，将每个探针分子通过多个化学键与基材表面结合，大大增加了探针的稳定性和降低了背景噪声的影响。但这种方法对探针长度要求较高，一方面，如果探针长度过短，多个化学键的固定会使得探针固结于基材表面，使得杂交效率低或无法杂交；另一方面，探针长度短，为兼顾杂交特异性和杂交效率，对于固定探针的化学修饰剂的浓度配比要求则极为苛刻，如果探针长度足够长则有比较宽泛的比例范围可选择，便于大批量的操作。该专利中描述的探针制备技术是通过两步完成，首先，对化学合成的短的探针序列进行5’磷酸化；然后，在一个短的辅助接头序列的帮助下，进行连接反应，使短的探针序列头尾相接成长序列。这种做法仍然存在一定缺陷。因为在连接反应进行过程中，所有探针分子及辅助接头分子的碱基都是以单链的形式开放着的，对于大量的不同的探针序列，难以避免他们自身或之间相互作用，形成复杂的二级结构，进而影响连接效率。这严重制约了该方法的广泛应用。同时，因为要发生多个连接反应，探针分子才能连接足够长度，这对连接酶的活性和用量以及反应时间和温度等条件的要求都较高。连接的探针直接用于芯片生产，对化学合成的短探针和制备各环节酶用量的消耗都较高，成本较高。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过环状单链探针制备长探针的方法。

本发明的另一发明目的在于提供上述通过环状单链探针制备长探针的方法在基因芯片生产中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种通过环状单链探针制备长探针的方法，包括如下步骤：

(1)通过方案(A)或(B)获得环状单链探针；