[发明专利]一种通过环状单链探针制备长探针的方法及其在基因芯片生产中的应用

权利要求书

1.一种通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）通过方案（A）或（B）获得环状单链探针；

（A）探针和扩增接头连接成环；

1）设计复合探针：复合探针的结构为序列1、短探针、序列2和序列3依次连接；其中，序列1和序列2互为反向互补的序列；

2）设计复合扩增位点：复合扩增位点的结构为序列4、通用扩增引物位点、序列5和序列6依次连接；其中，序列4和序列5互为反向互补的序列；并且序列6与步骤1）中所述的序列3为反向互补匹配的序列，为非回文结构；

3）环状单链探针的制备：将复合探针和复合扩增位点混合，磷酸化，退火，使分子内形成发卡结构并进行连接反应，形成包含一个拷贝探针的复合环状分子；

（B）探针自身连接成环；

①设计复合探针：复合探针的结构为序列1、短探针、序列2和序列3依次连接；其中，序列1和序列2互为反向互补的序列，序列3是回文结构；

②环状单链探针的制备：将复合探针磷酸化，退火，使分子内形成发卡结构并进行连接反应，形成包含至少两个拷贝探针的复合环状分子；将复合环状分子、扩增引物和DNA聚合酶进行滚环扩增，得到环状单链探针；

（2）由步骤（1）得到的环状单链探针制备直链单链的长探针；

（A）对于步骤（1）方案（A）获得的环状单链探针，使用能与扩增接头互补的扩增引物进行扩增，得到长探针；

（B）对于步骤（1）方案（B）获得的环状单链探针，使用针对于探针的特异性引物进行扩增，得到长探针；

所述的序列4和序列5与所述的序列1和2为完全不匹配序列。

2.根据权利要求1所述的通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于：

步骤1）中所述的复合探针为一种探针或多种探针混合物；

当所述的复合探针为多种探针混合物时，不同的探针之间的序列1和序列2应互相不匹配，序列3为相同的序列；

所述的短探针为基因芯片所选择的待检测目标序列或目标序列的反向互补序列；

步骤2）中所述的通用扩增引物位点是长度为10～30nt，GC含量为40%～60%，且与芯片检测目标序列相似性低于50%的序列。

3.根据权利要求1所述的通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于：

步骤1）中所述的短探针的长度为20～60nt；

步骤1）中所述的序列1的长度为5～10nt；

步骤1）中所述的序列2的长度为5～10nt；

步骤1）中所述的序列3的长度为1～8nt；

步骤2）中所述的序列4的长度为5～10nt；

步骤2）中所述的序列5的长度为5～10nt；

步骤2）中所述的序列6的长度为1～8nt。

4.根据权利要求1所述的通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于：

步骤3）中所述的复合探针和所述的复合扩增位点按摩尔比1：1～5配比；

步骤3）中所述的退火的条件为：于90～100℃保温1～10min，然后缓慢降温至室温。

5.根据权利要求1所述的通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于：

步骤①中所述的复合探针为一种探针或多种探针混合物；

当所述的复合探针为多种探针混合物时，不同的探针之间的序列1和序列2应互相不匹配；

步骤②中所述的复合环状分子中的探针为相同序列的探针或不同序列的探针；

步骤②中所述的扩增引物为针对于探针的特异性引物；

所述的针对于探针的特异性引物为具有如下特征的引物：长度为10～30nt，GC含量为40%～60%；

当所述的复合探针为多种探针混合物时，所述的针对于探针的特异性引物为与不同探针互补的引物形成的混合物。

6.根据权利要求1所述的通过环状单链探针制备长探针的方法，其特征在于：

步骤①中所述的短探针的长度为20～60nt；

步骤①中所述的序列1的长度为5～10nt；

步骤①中所述的序列2的长度为5～10nt；

步骤①中所述的序列3的长度为2～8nt。