[发明专利]一种复合启动子及其在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用

说明书

本发明提供一个复合启动子，所述复合启动子由2‑5个tac启动子核心序列排列而成。本发明还提供带有该复合启动子的载体、工程重组菌及该工程重组菌的制备方法。该带有复合启动子的工程重组菌可高效表达醛脱氢酶，从而快速催化3‑HPA生产3‑HP，一方面防止3‑HPA的积累对细胞生长代谢的削弱，另一方面可提高3‑HP的产量。

技术领域

本发明属于生物化工生产领域，涉及一种复合启动子及其在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用。

背景技术

3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionic acid，3-HP)是重要的平台化合物，具有广阔市场前景。化学合成3-HP难度大，分离纯化困难，而且污染环境，因此制约了其大规模的应用。生物法生产3-HP具有低成本、易操作、条件温和、环境友好等优势。肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)具有较高的甘油耐受性、较强的甘油代谢能力，且自身可合成辅酶B₁₂等特点，因此成为利用甘油生物法生产3-HP的优势宿主菌。K.pneumoniae利用甘油脱水酶(DhaB)催化甘油生成3-羟基丙醛(3-HPA)，3-HPA在醛脱氢酶(ALDH)的催化下生成3-HP。

由于甘油脱水酶的活性高于醛脱氢酶，导致3-HPA的积累，3-HPA对细胞具有毒性，因此消弱细胞的生长代谢。为了高产3-HP，需要提高醛脱氢酶的活性。启动子作为重要的基因表达调控元件，其活性直接影响到外源基因能否高效表达。K.pneumoniae为非模式生物，缺少合适的强启动子使醛脱氢酶高效表达，造成3-HP的生产过程转化率较低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种复合启动子，该启动子可高效表达醛脱氢酶，从而快速催化3-HPA生产3-HP，一方面防止3-HPA的积累对细胞生长代谢的削弱，另一方面可提高3-HP的产量。

本发明的第二个目的在于提供一种重组载体。

本发明的第三个目的在于提供一种上述重组载体的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供一种生产3-羟基丙酸的肺炎克雷伯氏杆菌重组菌。

本发明的第五个目的在于提供一种上述生产3-羟基丙酸的肺炎克雷伯氏杆菌重组菌的制备方法。

本发明的第六个目的在于提供一种上述复合启动子或带有复合启动子的重组载体在提高肺炎克雷伯氏杆菌的3-羟基丙酸产量中的应用。

为了实现上述目的，本发明提供一种复合启动子，所述复合启动子含有2-5个tac启动子核心序列；

其中，当该复合启动子含有2个tac启动子核心序列时，序列如Seq ID No.2所示；

当该复合启动子含有3个tac启动子核心序列时，序列如Seq ID No.3所示；

当该复合启动子含有4个tac启动子核心序列时，序列如Seq ID No.4所示；

当该复合启动子含有5个tac启动子核心序列时，序列如Seq ID No.5所示。

本发明还提供一种重组载体，由上述的复合启动子、puuC醛脱氢酶基因和pET-28a载体组成，其中puuC醛脱氢酶基因序列如Seq ID No.6所示；该重组载体为表达载体。

本发明还提供上述重组载体的制备方法：包括如下步骤：

1)用限制性内切酶Bgl II/EcoR I分别对复合启动子序列和pET-28a载体进行双酶切；

2)电泳，琼脂糖凝胶回收酶切后的复合启动子片段和pET-28a载体片段；

3)使用连接酶将复合启动子片段和pET-28a载体片段连接，得到含有复合启动子片段的载体；