[发明专利]一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒。本发明的多重扩增建库方法可以实现以痕量DNA甚至单细胞水平的DNA为模板进行多重扩增测序，且全部反应过程可在单管内实现。通过实验证明：本发明的建库方法在单细胞的水平上实现了多达207重的一管式扩增子扩增，且保真度高于现有的商品化试剂盒，不仅具有操作便捷、成本经济、测序质量高和灵敏度高的优点，而且还可以满足两个测序平台的测序需求。适用于高通量低频突变检测领域如ctDNA突变检测领域以及低起始量DNA的胚系突变检测领域如单细胞突变检测筛选。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒。

背景技术

扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序，分析序列中的变异。扩增子测序可对目标区域进行高覆盖度的测序，便于低频突变检测，在探索复杂样本基因变异(例如具有异质性的体细胞突变等)进行测序等方面具有重要价值。在实际应用中，存在难度的是如何对低DNA起始量样本(包括有DNA降解的低起始量样本)进行高保真度的扩增子测序文库制备。

现有的针对于低起始量的技术方案主要是Life公司的Ampliseq产品的多重扩增技术，其具有简单方便、扩增效率高和均一性好的优点，是一种良好的靶向测序技术。Ampliseq产品与ion torrent半导体测序平台捆绑，其扩增产物，在加入FuPa试剂消化后，去除引物序列。然后加入Life公司的ion torrent测序接头，最后基于ion torrent测序平台进行测序。利用10ng DNA，只需一天，即可快速评估数百个关键突变。但该技术通常采用不小于10ng起始量的DNA进行扩增反应，而且采用ion torrent半导体测序技术进行突变检测，碱基错误率相对较高，不适用于polyN类型变异检测，一定程度上限制了对痕量样品的变异检测，特别是低频突变的检测。此外，Ion AmpliSeq^TM技术的扩增酶体系的保真度相对不高，可能会影响到低频突变的检测。对基于超低起始量的痕量DNA甚至于单细胞水平的DNA模板的多重扩增鲜有报道。

现在主流的基于扩增子测序平台主要包括Life公司的proton平台和Illumina公司的Hiseq平台，这两个公司分别有各自的样本扩增和建库的试剂盒。Life公司的相关试剂盒单轮运行成本较为经济、但受技术方法所限不适用于polyN类型变异检测，indel检测错误率相对较高。而Illumina平台虽然测序错误率相对较低，但其建库首先需要对核酸进行末端修复、磷酸化、加A等一系列反应，然后使用Y型粘端接头进行连接，连接完成进行文库扩增后才可进行测序，其成本高、步骤繁琐。由于两个平台所用的接头不同，使得建库产物在两个平台无法通用。因而开发一种可在两个平台通用的建库方法，综合两个平台的长处，具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于痕量DNA的多重扩增建库试剂盒。

本发明提供的试剂盒包括多重扩增体系、引物消化体系和接头连接体系；

所述多重扩增体系包括DNA聚合酶、PCR缓冲体系和多重扩增引物；

所述引物消化体系包括尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG酶，NEB)、尿嘧啶-N-糖化酶(UNG酶，Thermo)、核酸外切酶I(exonuclease i，Thermo)、8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶(Fpg，NEB)和Klenow片段(Klenow Fragment，NEB)中至少一种；

所述接头连接体系包括测序接头、T4DNA连接酶和DNA连接酶缓冲液。