[发明专利]一种用于痕量DNA的多重扩增建库方法及其专用试剂盒

权利要求书

1.一种痕量DNA文库建库的方法，包括如下步骤：

1）将DNA样本加入多重扩增体系进行多重PCR扩增，得到多重扩增产物；

2）将引物消化体系加入所述多重扩增产物中进行消化反应，得到消化产物；

3）将接头连接体系加入所述消化产物中进行接头连接反应，得到连接接头产物，即为构建的文库；

所述1）中，所述多重扩增体系由KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶、KAPA2G Robust DNA聚合酶、Pfu Turbo DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶中至少一种，2×Ion AmpliSeq™ PrimerPool以及1×PCR缓冲体系组成；所述KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为0.01~0.2U/μL；所述KAPA2G Robust DNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为0.01~0.2U/μL；所述Pfu Turbo DNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为0.01~0.2U/μL；所述KOD DNA聚合酶在所述多重扩增体系中的浓度为0.01~0.2U/μL；

所述2）中，所述引物消化体系由核酸外切酶I和Klenow片段中至少一种组成；所述核酸外切酶I在所述引物消化体系中的浓度为0.2~2U/μL；所述Klenow片段在所述引物消化体系中的浓度为0.2~4U/μL；

所述3）中，所述接头连接体系由测序接头溶液、T4 DNA Ligase和1×DNA连接酶缓冲液组成；所述T4 DNA Ligase在所述接头连接体系中的浓度为0.5~3U/μL；所述测序接头由接头甲和接头乙组成；所述测序接头溶液中接头甲和所述接头乙的浓度均为10~50μM；

所述接头甲是将单链DNA分子adoligo1与单链DNA分子adoligo3退火后得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo1的3'端反向互补配对形成双链结构；

所述接头乙是将单链DNA分子adoligo2与单链DNA分子adoligo3退火后得到的；所述单链DNA分子adoligo3与所述单链DNA分子adoligo2的3'端反向互补配对形成双链结构；

所述单链DNA分子adoligo1与所述单链DNA分子adoligo2的5'端序列不同；

所述接头甲和所述接头乙均为平末端接头；

所述单链DNA分子adoligo1的核苷酸序列如序列1所示；

所述单链DNA分子adoligo2的核苷酸序列如序列2所示；

所述单链DNA分子adoligo3的核苷酸序列如序列3所示；

或，所述测序接头为ion torrent接头；

所述1）中，将皮克至微克级别DNA样本加入所述多重扩增体系中；

或，所述DNA样本的起始量为单细胞水平；

所述1）中，所述多重PCR扩增的反应条件如下：90~99 ℃预变性1~3min；90~99℃变性10~30 sec，50~60℃ 退火2~5 min，共18~35个循环；4~15 ℃保持；

所述2）中，所述消化反应的条件如下：30~50 ℃反应10~30min；50~70℃反应10~30min；4~15℃反应0.5~2h；

所述3）中，所述连接反应的条件如下：10~30℃反应10~30min；60~80℃反应10~30min；4~15℃反应0.5~2h。

2.一种痕量DNA低频变异检测的方法，包括如下步骤：

（1）按照权利要求1所述的方法对待测痕量DNA样本进行多重扩增建库，得到待测序文库；

（2）将所述待测序文库进行测序，根据测序结果确定待测痕量DNA样本的变异情况；

所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述测序的平台可为Illumina测序平台或ion torrent测序平台。