[发明专利]一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法

说明书

本发明提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括引物、Bst DNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、Bst DNA聚合酶之间通过吸附结合。本发明还提供了上述等温扩增体系的扩增方法。本发明的高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够在常温下将LAMP体系中高浓度的引物吸附在金纳米颗粒表面，同时也能够吸附Bst DNA聚合酶从而抑制其活性，阻止引物之间的错配及延伸，显著提高LAMP的特异性和检测的可靠性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种便捷高效的具有极高特异性的热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法。

背景技术

核酸检测作为一种具有高灵敏度及特异性的方法，目前已经广泛应用于许多领域，例如疾病诊断，食品安全，传染病防治等。

PCR(聚合酶链式反应)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。然而，PCR作为经典的核酸检测方法，其固有的变性-复性-延伸循环，要求其必须需要热循环仪设备作为支撑，因而极大地限制了PCR在床旁快速诊断等领域的应用。

为了克服这些缺点，一大类等温核酸扩增的新方法大量出现，其中LAMP是最受关注也是最有应有前景的一种方法。

LAMP(环介导等温扩增技术)是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。然而，以LAMP为代表的等温核酸扩增方法均有一个类似的缺点，即有严重的非特异性扩增现象，导致核酸检测时时常出现假阳性问题，极大地限制了等温核酸扩增方法的应用，尤其是限制了LAMP的实际应用。

研究发现，造成LAMP假阳性率高的原因主要是：其引物浓度高，长度长，且没有特异性的退火温度，所有的反应均在65℃左右进行，导致引物之间错配及自我延伸的概率极高，且LAMP目前还缺乏特异性荧光探针的检测方法，目前应用的多为非特异性嵌入式荧光的方法，导致难以区别错配延伸和真正目的序列所产生的信号。并且，应用于LAMP的BstDNA聚合酶具有强大的聚合能力，该酶反应的最适温度为65℃，但其在常温下也具有一定的活性，这为引物错配后的延伸造成的假阳性提供了支持。

截止目前，还没有一种能够显著改善传统LAMP中的非特异性扩增问题的环介导等温扩增技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系及扩增方法，能够在常温下将LAMP体系中高浓度的引物吸附在金纳米颗粒表面，同时也能够吸附Bst DNA聚合酶从而抑制其活性，阻止引物之间的错配及延伸，显著提高LAMP的特异性和检测的可靠性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种高特异性热启动型环介导等温扩增体系，所述等温扩增体系包括引物、Bst DNA聚合酶和金纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒与引物、BstDNA聚合酶之间通过吸附结合。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述金纳米颗粒的颗粒尺寸为5nm～15nm，所述金纳米颗粒的加入量为4ng～100ng。

进一步地，选用A群轮状病毒NSP5基因作为模板DNA，采用如SEQ ID NO：1所示序列作为靶序列；针对该靶序列，采用如SEQ ID NO：2～5所示序列作为引物。