[发明专利]用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用

说明书

本发明公开了检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR引物和探针及其应用，所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。本发明能够快速、准确、高效地检测出样品中的WU多瘤病毒，具有较高的灵敏度和特异性。该套引物和探针可用于多种方面，如临床疾病诊断、抗病毒药物筛选、环境监测与评价、卫生监督与口岸卫生检疫、流行病学调查等。

技术领域

本发明属于微生物检测技术，尤其是人呼吸道感染WU多瘤病毒的核酸检测技术范畴的用于检测WU多瘤病毒的荧光定量PCR的引物和探针及其应用。

背景技术

WU病毒是2007年5月由美国的Anne M.Gaynor等学者首先通过分子病毒筛查方法从急性呼吸道感染患儿的鼻咽抽取物中发现的。该病毒属于多瘤病毒科，是人类疾病相关的第四种多瘤病毒。暂时将该病毒称为WU(Washington University)病毒(与人类多瘤病毒双字母病毒命名一致)。WUPyV在结构上，它与其它多瘤病毒一样，由20面体衣壳和一闭合环状双链DNA组成；在基因组成上，却与多瘤病毒属中BK病毒(BK polyomavirus)、JC病毒(John Cunningham polyomavirus)有明显不同，而与KI病毒(Karolinska Institutepolyomavirus)有相似之处。

WUPyV基因组有5229bp(GC含量占39％)，编码大T抗原(LTAg)、小T抗原(STAg)及3种核衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。早期区(early region)基因编码LTAg和STAg，而在相反链上晚期区基因编码核衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)。早期编码区和晚期编码区被中间调控区分开，该区是一个位于复制起点晚期侧富含AT区域，具有典多瘤病毒特征。在该调控区大多数多瘤病毒存在四个相同序列，而WUPyV调控区存在LTAg三个相同序列结合位点(GAGGC)和一个序列不同结合位点(TAGGC)。该调控区独特之处是它包括两个部分重叠LTAg的结合位点，彼此之间还存在着细微差异。而在早期编码区，有一个由194个氨基酸组成开放阅读框，可能编码STAg。LTAg同样具有高度保守性，该区包括N(氨基)端DnaJ区六肽序列HPDKGG、结合Rb必需L×C×E序列、DNA结合区、锌指结构和ATPase-p53结合区保守模序GP×××GKT以及G×××VNLE。到目前为止，不同国家检出WUPyV核苷酸序列均表现出高度一致性。

目前，WUPyV在小儿呼吸道感染中的检测率在全世界各地报道差异较大，约在0.7％～9％之间。该病毒在美国Anne M.Gaynor和Binh-Minh Le等的研究中的检出率分别是0.7％和2.7％，而澳大利亚、法国、德国、荷兰和我国的检出率分别是4.5％、2.4％、4.9％、9％和4.2％。加拿大的检出率为2.5％(有症状)和6.4％(无症状)，而韩国的检出率相对高，达7％(有症状)和4.2％(无症状)，不同检出率差异是WUPyV生物学特征所致，还是因实验设计不同而异，还待进一步研究。

大多数报道称该病毒可贯穿全年感染，但多数发生在冬季。美国Binh-Minh Le等从2003年7月到2004年6月研究中发现2003年7月是第一个季节性高峰，2004年4、5月是第二个高峰；在澳大利亚多数病例发生于冬末夏初，高峰在10月和12月；在加拿大检出WUPyV阳性病例主要集中在12月至次年4月；在韩国集中在5、6、12月，即冬末夏初；而在德国主要集中在冬季；在荷兰主要集中在呼吸道感染高发季节即冬春季；在法国则无明显季节性高峰；在我国标本采集来自各个月份，但主要集中在秋冬季。国内的庄婉莉等对15份WUPyV感染阳性的标本的DNA进行基因序列检测，结果显示WUPyV的VP2基因片段与GenBank库中韩国毒株的VP2衣壳蛋白基因的同源性为99.6％，与美国、浙江和北京的毒株的同源性均为100％。这些均表明WUPyV可能是一种高度保守的病毒。