[发明专利]宫颈癌生物标志物检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种宫颈癌生物标志物检测试剂盒，其中，所述宫颈癌生物标志物检测试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，检测TNF‑α启动子rs361525位点，其中：高效扩增组包括测序引物和Taq DNA聚合酶，扩增引物序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序。本发明采用线性指数扩增的目标片段扩增方法，精准设计的扩增引物扩增效率高且错配少，不仅大大增加了扩增效率，且直接扩增出单链DNA可直接用于焦磷酸测序，无需对扩增产物进行标记和双链分离，避免了繁冗的实验步骤，也减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤。

技术领域

本发明涉及一种宫颈癌生物标志物检测试剂盒，属于临床试剂盒领域。

背景技术

宫颈癌(cervical cancer)是女性生殖系统最为常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家的妇女癌症死因中占88％。自20世纪80年代以来，人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)与宫颈癌的关系越来越明确，世界卫生组织已经于1996年确认HPV是宫颈癌的主要病因。但是HPV感染并不是宫颈癌的唯一致病原因，70％以上的HPV感染具有一过性，病毒可在6-8个月内被清除，只有大约20％的高危型HPV感染会长期持续存在，导致浸润性宫颈癌的发生，HPV感染的持续化与宫颈癌发生的危险性增高有关。因此，有效的免疫环境能够监视并清除HPV感染，减少宫颈癌的发生。基因差异可影响机体免疫反应，可能决定了宫颈癌变的危险性大小。

肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNF-α)是一种多效性的免疫因子，在病毒的免疫清除中具有重要作用，TNF-α基因的单核苷酸多态性具有生物学上的重要性，可以影响TNF-α的产量和活性，从而可能从基因水平影响疾病的易感性。研究发现宫颈癌患者的宫颈阴道冲洗液中TNFα的含量升高，在转染HPV的细胞株中可以检测到TNFα的释放并且发现这些细胞的生长受到抑制。说明TNFα基因的多态性可能与宫颈癌的易感性有关。经过临床验证，编码TNFα的基因位于人类染色体的6q21，TNFα基因的单核苷酸多态性与宫颈癌的关系已涉及多个位点，如-238、-244、-163、-376和-308等，其中-238位点与宫颈癌的危险性关联比较大。由于目前临床宫颈癌的早期检测和筛查没有较为成熟的方式，设计一款以TNF-α基因多态性作为宫颈癌的发病标志物进行检测，具有较为重要的临床意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种宫颈癌生物标志物检测试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明采用的宫颈癌生物标志物检测试剂盒的技术方案如下：

所述宫颈癌生物标志物检测试剂盒由高效扩增组和焦磷酸测序组组成，检测TNF-α启动子rs361525位点，其中：高效扩增组包括测序引物和Taq DNA聚合酶，扩增引物序列如序列表SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，扩增产物退火后经焦磷酸测序组测序。

本发明中的测序引物特异性高、准确性好，序列用于线性指数PCR(LATE-PCR)可以大量产生便于焦磷酸测序的单链DNA，无需对常规的双链DNA进行解螺旋和分离。

引物序列中有一条为过量引物，一条为限制性引物，过量引物和限制性引物与正向引物和反向引物之间并无明确的制定关系，可以根据需要扩增的片段单链来选择扩增量，扩增量大的链对应的扩增引物即为过量引物，另一条链对应的扩增引物为限制性引物。

设计引物时，由于线性指数PCR对于引物的要求较高，要求引物之间的Tm值之差≥5℃，扩增产物与过量引物之间的Tm值之差≤13～18℃。这样可以保证最佳的延伸效果，但该温度要求不是绝对的，只要能够通过LATE-PCR扩增出待测的目的产物，就可以采用。

优选的，本发明中如序列表SEQ ID NO：1所示的引物为过量引物，如序列表SEQ IDNO：2所示的引物为限制性引物。