[发明专利]DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞

说明书

本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。本发明将人外周血单核细胞通过基因改造，使之成为可在体外持续培养的永生化细胞株。本发明通过IL‑4和GM‑CSF诱导PBMC，并转染SV40大T抗原和MYC‑ER融合蛋白基因，从而获得永生化DC细胞株。这种永生化的DC细胞株可在体外长时间大量培养，能有效提呈抗原并在体外使T细胞激活并迅速扩增。该永生化的树突状细胞株可用于提呈肿瘤或病原体特异性抗原，为肿瘤及传染性疾病的免疫治疗提供一个方便、高效的平台。

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，特别涉及DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。

背景技术

免疫治疗(immunotherapy)是指针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的一种治疗方法。

肿瘤细胞或病原体的感染会激活人体内的T淋巴细胞产生免疫应答以抵抗这些疾病。T淋巴细胞的激活需要一类称为抗原提呈细胞(APC) 的参与。抗原提呈细胞主要包括树突状细胞(DC)，巨噬细胞和B淋巴细胞，其中树突状细胞是最为重要，也是最为高效的抗原提呈者。抗原提呈细胞把来自于肿瘤或病原体的抗原蛋白经过消化，处理后，以小肽的形式将这些抗原提呈到细胞表面，一旦这些抗原信号被T淋巴细胞识别，后者就被激活并扩增。大量活化的T细胞会攻击并杀死肿瘤细胞或被病原体感染的细胞，从而发挥免疫的功能。

在一些慢性疾病如肿瘤或病原体引发的慢性炎症疾病中，T淋巴细胞的免疫功能会随着时间逐渐钝化，失去对肿瘤细胞的杀伤效果。此外，肿瘤组织中浸润的T淋巴细胞往往含量很少，达不到足够的杀伤效果，这些是造成肿瘤免疫逃逸的主要原因。

在理想情况下，一个良好的免疫治疗策略应该满足以下条件：第一，在较低的效应细胞/肿瘤细胞比例(E:T比值)时，即具有较好的抗肿瘤效果，由此最大限度地减少注入患者的细胞数量，可同时降低成本和风险；第二，“现成化”模式，抗肿瘤免疫细胞可源于健康捐献者且不引起移植物抗宿主病并发症(GVHD)，从而提供经济、有效的治疗，并且显著减少病人等待时间；第三，尽量规避基因改造可能带来的毒副作用， CAR-T细胞经过基因工程改造，可长时间存留在病人体内，存在未知风险；第四，免疫细胞质量的优化，虽然激活免疫细胞的方法有多种，但是通过树突状细胞激活免疫细胞符合机体自然规律，被认为是最好的方法之一。

当前临床上针对肿瘤的免疫治疗主要基于来自病人自体的T淋巴细胞，包括T淋巴细胞的分离、抗原特异性T细胞的体外激活、扩增及回输等四个步骤。其中抗原特异性T细胞群的扩增是该治疗策略中极为关键也是极具挑战性的步骤。目前常用的手段有以下两种1)利用CD3， CD28抗体和IL12混合物刺激T细胞。该方法为T细胞提供了激活、扩增、生存三种关键信号，但是这些信号的呈现方式与体内APC的抗原自然呈递过程完全不同，可能导致T细胞扩张速度慢，功能受限或功能失调；2)利用病人自体分离的DC细胞或经由单核细胞刺激分化而来的DC 细胞来激活、扩增T细胞。这种方法与体内的抗原提呈方式相同，但受限于病人血液中极低的DC细胞含量，无法满足扩大化的临床需求。而且这些DC细胞在体外无法长期生存，往往短期培养后就会死亡。

因此，如何在体外以尽可能接近自然的方式提呈肿瘤或病原体抗原来激活具有靶标特异性的T淋巴细胞，并实现其快速、大量的扩增是目前T细胞免疫治疗领域的一个亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种DNA分子、含有该DNA分子的载体以及获得的永生化细胞。本发明提供一种通过IL-4和GM-CSF诱导PBMC，并转染SV40大T抗原和MYC-ER融合蛋白基因，从而获得永生化DC 细胞株的方法；这种永生化的DC细胞株可在体外长时间大量培养，能有效提呈抗原并在体外使T细胞激活并迅速扩增。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：