[发明专利]一种马铃薯StDWF1基因及其制备方法以及过表达该基因以促进马铃薯快速生根的方法

权利要求书

1.一种马铃薯StDWF1基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种马铃薯StDWF1基因的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从马铃薯品种费乌瑞它试管苗中提取总RNA；

(2)根据提取的总RNA反转录合成cDNA；

(3)PCR扩增，以cDNA为模板，在cDNA的CDS区前引入XbaI和SmaI酶切位点，设计扩增引物StDWF1PF和StDWF1PR，并添加引物StDWF1PF、引物StDWF1PR、10×扩增缓冲液、无菌水、dNTPs、Taq DNA聚合酶混匀并进行PCR扩增，其中，cDNA、引物StDWF1PF、引物StDWF1PR、10×扩增缓冲液、无菌水、dNTPs、Taq DNA聚合酶的容积分别为：1μL、1μL、1μL、2μL、15.3μL、0.5μL、0.2μL，并且cDNA、引物StDWF1PF、引物StDWF1PR以及dNTPs的浓度分别为10～100ng/L、2μM/μl、2μM/μl、10mmol/L；

扩增引物StDWF1PF、StDWF1PR的碱基序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示；

(4)回收纯化PCR扩增产物，经测序分析得到马铃薯StDWF1基因。

3.如权利要求2所述的一种马铃薯StDWF1基因的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，提取费乌瑞它试管苗总RNA的时机是叶片出苗期，提取部位是费乌瑞它试管苗的嫩叶。

4.如权利要求2所述的一种马铃薯StDWF1基因的制备方法，其特征在于，步骤(1)中总RNA的提取方法采用Trizol法，具体步骤如下：

(1a)研磨：研钵放入4勺液氮和马铃薯品种费乌瑞它样品部位，液氮挥发完后迅速磨成细粉，迅速装入EP管后加1mL Trizol，剧烈混匀，室温放5-10min；

(1b)4℃12000rpm离心5min，吸取上清至新管中，并加入200ml氯仿，轻微上下摇晃，室温静置5min；

(1c)4℃12000rpm离心10min，吸取上清液到新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀；

(1d)4℃12000rpm离心20min，吸取上清液到新管，逐渐加入无水乙醇使其终浓度为12％，上下颠倒混匀后迅速离心；

(1e)4℃12000rpm离心10min，吸取400mL上清液到新管，加入0.7倍体积异丙醇上下颠倒混匀，并加入0.2倍体积1mol/L NaAc-20℃沉淀1h；

(1f)4℃12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃、8500rpm离心3min，再加1mL 75％乙醇洗2遍；

(1g)倒掉上清，尽量吸掉多余液体，超净台上吹风10min除残留乙醇，加入80mLDEPC处理水，立即放入55℃水浴5min，-80℃60min，重复2次；

(1h)4℃12000rpm离心20min，小心吸取上清70μL，注意不接触底部，即得到总RNA，于-80℃冻存备用；

其中，步骤(1c)-(1h)均在冰上操作。

5.如权利要求2所述的一种马铃薯StDWF1基因的制备方法，其特征在于，步骤(2)中总RNA反转录合成cDNA，按TakaRa公司的cDNA合成试剂盒使用说明进行反转录，总反应体系体积为20μl，使用RNase free离心管，反应体系如下：

65℃变性5分钟，迅速在冰上冷却至少1分钟，稍微离心，然后加入：

混合均匀，55℃反应60min，70℃15min使酶失活，-20℃保存。