[发明专利]一种新型木糖苷酶及其基因、工程菌、制备方法和应用

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于短小芽孢杆菌的新型木糖苷酶及其基因、工程菌、制备方法和应用。其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术获得该新型木糖苷酶的基因，然后将该新型木糖苷酶基因，分别在枯草芽孢杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性木糖苷酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性木糖苷酶游离表达重组菌株，实现新型木糖苷酶的制备，解决现有技术中木糖苷酶在低温条件下活力低的问题，同时该新型细菌木糖苷酶在木聚糖酶的协同作用下彻底分解木聚糖和利用木糖合成木二糖有较好的作用。

技术领域：

本发明涉及一种来源于短小芽孢杆菌的新型木糖苷酶及其基因、工程菌和制备方法和应用，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型木糖苷酶的重组表达菌株，以及该细菌木糖苷酶蛋白与木聚糖酶协同分解木聚糖和利用木糖合成木二糖的应用，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术：

木糖苷酶(β-D-xyloside xylohydrolase，EC 3.2.1.37)是一种外切酶，主要催化水解木糖苷和以外切方式从非还原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解产物为木糖。在自然界中广泛分布，真菌、细菌、放线菌等微生物均可产生，此外大麦等高等植物也可产生木糖苷酶。

多数细菌和酵母主要产生胞内木糖苷酶，而一些真菌则能产胞外木糖苷酶。β-木糖苷酶蛋白有单体，二聚体，三聚体等，分子量一般为26-400KDa。β-木糖苷酶分为胞外型、胞内型和膜结合型。纯化后的β-木糖苷酶一般不具有其他酶活性，但也有一些木糖苷酶为双功能酶或多功能酶，例如，一些木糖苷酶具有阿拉伯糖苷酶等活性。目前，β-木糖苷酶已广泛应用于包括食品、药品、造纸、能源等多个领域。

木聚糖是来源丰富的自然资源，且工农业生产的废弃物中也存在大量的木聚糖。如将其降解可作为碳源产生多种发酵产物，因此木聚糖酶系被广泛关注。而木糖苷酶是木聚糖彻底降解为木糖的关键酶之一，如酒精等许多发酵产物都必须通过木糖转化产生。因此，木糖苷酶也开始受到重视。

在造纸工业中，传统的硫酸盐制浆法会有木质素残留，会影响纸浆质量降低纸张强度。目前去除木质素广泛采用的化学漂白法，使工业废水中含有大量有毒物质，严重污染环境，若减少有毒化学物质使用则会提高处理成本。采用生物漂白剂进行处理，减少了有害化学物质的使用，对经济和环保具有重大意义。β-木糖苷酶单独处理或与木聚糖酶共同处理麦草浆则可以明显提高纸浆质量。

同时，β-木糖苷酶具有的转糖基作用能够形成新的糖苷键使寡糖链增长。Aspergillus awamori X-100中的β-木糖苷酶表现出了非常高的转糖基能力，能产生聚合度水平高于七的木寡糖。Talaromyces amestolkiae中的GH3家族β-木糖苷酶BxTW1利用这种特性能够利用转糖基作用合成木二糖和木三糖等化合物。

β-木糖苷酶被广泛应用于食品、生物转化和造纸行业等工业，但是在实际应用中面临着一个比较突出的问题：为了减少食品中活性成分、风味物质和营养成分的损失，一些如葡萄酒发酵和果汁澄清等食品加工过程通常需要在低温条件下进行(<30℃)，但当前工业应用的木糖苷酶都属于中高温酶(40-60℃)，它们在低温条件下(0-20℃)的活力很低甚至完全丧失，如果不解决木糖苷酶在低温条件下活力低的问题，将严重限制其在食品加工及其他需要低温处理工业中的应用。

枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。