[发明专利]金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立

说明书

本发明涉及用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立，属于生物检测技术领域。本发明提供了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7 wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，并建立了金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157：H7、沙门氏菌三重荧光定量PCR方法。本发明的PCR检测方法灵敏度高且具有很好的重复性。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立。

背景技术

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌这3种细菌是引起人类食源性疾病的重要病原菌。

金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属成员，是革兰氏阳性球菌中的一种，绝大部分葡萄球菌属是不致病，少数可引起人类或动物致病，属于人畜共患致病菌。而金黄色葡萄球菌致病性最强，除了常引起皮肤、组织及器官的化胳性炎症外，其产生的肠毒素也可污染猪肉而导致食物中毒。

大肠杆菌O157：H7是肠出血性大肠杆菌中的典型菌株，其具有较强的耐酸性，37℃下，在pH2.5-3.0时，可耐受5h。大肠杆菌O157：H7是重要的食源性致病菌，可以长期在动物体内存在，并不断从体内排出，对周围环境和动物胴体造成污染，很容易导致食品污染。

沙门氏菌为两端钝圆的短杆菌，革兰氏阴性菌，无荚膜和芽胞，除鸡伤寒沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌外都有周身鞭毛，能运动，大多数具有菌毛。其分为种抗原结构，菌体抗原(O)，鞭毛抗原(H)及表面抗原(Vi)。该菌对营养要求不高，在普通琼脂培养基上生长良好，需氧及兼性厌氧菌。生长温度范围为5-46℃，最适生长的温度为35-37℃，最适生长的pH为 6.8-7.8，在液体培养基中呈混独生长。

近年来，国内外对致病菌的检测一直是研究的热点，检测方法主要包括常规检测方法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法等

常规的PCR方法具有快速、准确、操作简单、灵敏度和特异性高、检测成本低等诸多优点，然而在食品生产和流通中，企业和政府部口均需对大批食品进行致病菌的检测，样品量大，时间急，同时，食品样品中往往存在的致病菌种类较多，而常规的PCR一次试验只能检测一种致病菌。

单独的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌荧光定量PCR检测方法技术已经成熟并且有专门的检测试剂盒产品，但是还没有三种细菌的联合检测方法。若同一份样品需检测上述三种致病菌，则需要用不同的体系和样品量，即检测上述三种致病菌需要做三次试验，不利于大批量同时检测上述三种致病菌。因此亟需一套体系与方法能够检测出上述三种细菌的污染情况。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物、探针及方法建立。

本发明采用如下技术方案：

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌三重荧光定量PCR检测的引物和探针，包括分别以金黄色葡萄球菌nuc基因、大肠杆菌O157：H7wzx基因、沙门氏菌invA基因为对象的三组引物和探针，所述三组引物和探针分别具有以下碱基对：

以金黄色葡萄球菌nuc基因为对象：

上游引物(5’-3’)TTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGC

下游引物(5’-3’)TTGCACTATATACTGTTGGATCTTCAG

探针(5’-3’)FAM-TGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAG-BHQ1；

以大肠杆菌0157：H7wzx基因为对象：