[发明专利]用于荧光PCR检测的DNA快速提取方法和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法

说明书

本发明公开了用于荧光PCR检测的DNA快速提取方法和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法。用于荧光PCR检测的DNA的快速提取方法为取检测样本全血加入裂解液；52‑57℃下第一次孵育；92‑98℃下第二次孵育；然后离心即得到待检DNA；然后进行荧光定量PCR检测即可。本发明方法操作简单，省时高效，特异型强、灵敏度高、稳定性好，适用于大规模的临床应用。

技术领域

本发明涉及多态性检测领域，尤其涉及用于荧光PCR检测的DNA快速提取方法和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)，是叶酸-甲硫氨酸代谢过程中的重要酶之一，它能使血液中的同型半胱氨酸(Hcy)维持在较低的水平。MTHFR在677位点有三种基因分型：野生型CC、杂合突变型CT和纯合突变型TT。该位点发生突变，可能会使酶活性降低，影响叶酸代谢，导致血液中Hcy水平升高，从而引发心血管疾病、脑血管疾病等。因此对于高危人群，如原发性高血压患者、伴有同型半胱氨酸升高的高血压患者、伴有高血脂和高血糖等危险因素的高血压患者、已经发生心脑血管疾病的患者、有心脑血管疾病家族史的人群、孕妇等进行MTHFR C677T基因多态性的检测，能够预防心血管疾病、脑血管疾病的发生，对于判断高血压种类以及后续用药指导都具有重要意义。也可指导孕妇合理补充叶酸，预测唇腭裂、唐氏综合症、神经管缺陷等新生儿出生缺陷，适用于正常夫妇生育前预防性检测。然而，传统的MTHFR检测方法都需要对DNA进行纯化，而DNA纯化过程又十分繁琐，耗费的人力、物力、资源巨大，而且会有样本间交叉污染的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种省时高效，特异型强、灵敏度高、稳定性好，适用于大规模的临床应用的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供一种用于荧光PCR检测的DNA的快速提取方法，其特征在于，取检测样本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后离心即可。

进一步，所述裂解液配方为5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性剂，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化铵，10～200mM的氯化钠，pH值为6.5～8.5；优选的，表面活性剂为SDS或NP-40或Brj-35；

任选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：(8～15)；优选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：(8～12)；更优选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：11。

进一步，所述第一次孵育的温度为53～56℃；优选的，第一次孵育的温度为55℃；

任选的，所述第一次孵育的时间为8～12分钟；优选的，第一次孵育的时间为10分钟；

所述第一次孵育的温度为93～97℃；优选的，第一次孵育的温度为95℃；

任选的，第二次孵育的时间为3～8分钟；优选的，第二次孵育的时间为5分钟；

任选的，离心的时间为0.5～2分钟；优选的，离心的时间为1分钟。

本发明还提供一种亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法，其特征在于，采用上述方法提取DNA后进行荧光定量PCR检测。

进一步，所述荧光定量PCR的引物和探针为SEQ ID NO:1-4所示序列；

任选的，所述荧光定量PCR的20μL反应体系为：10μL的2×TaqMan Fast AdvancedMaster Mix、浓度为300nM的引物、浓度为250nM的探针、2μL待测样本，余量为无菌水；