[发明专利]用于荧光PCR检测的DNA快速提取方法和亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法在审
| 申请号： | 201810561497.2 | 申请日： | 2018-06-04 |
| 公开（公告）号： | CN108715887A | 公开（公告）日： | 2018-10-30 |
| 发明（设计）人： | 陈雯雯;郑佳莹;刘晓蕾;陈永欣 | 申请（专利权）人： | 深圳大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12Q1/6858;C12Q1/6883 |
| 代理公司： | 厦门市精诚新创知识产权代理有限公司 35218 | 代理人： | 秦华 |
| 地址： | 518060 广东省深*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 荧光PCR检测 快速提取 亚甲基四氢叶酸还原酶基因 次孵育 多态性 检测 荧光定量PCR检测 临床应用 省时高效 裂解液 灵敏度 特异型 全血 样本 | ||
1.一种用于荧光PCR检测的DNA的快速提取方法，其特征在于，取检测样本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后离心即可。
2.权利要求1所述用于荧光PCR检测的DNA的快速提取方法，其特征在于，所述裂解液的配方为5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性剂，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化铵，10～200mM的氯化钠，pH值为6.5～8.5；优选的，表面活性剂为SDS或NP-40或Brj-35；
任选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：(8～15)；优选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：(8～12)；更优选的，检测样本全血与裂解液的体积比为1：11。
3.权利要求1所述用于荧光PCR检测的DNA的快速提取方法，其特征在于，所述第一次孵育的温度为53～56℃；优选的，第一次孵育的温度为55℃；
任选的，所述第一次孵育的时间为8～12分钟；优选的，第一次孵育的时间为10分钟；
所述第一次孵育的温度为93～97℃；优选的，第一次孵育的温度为95℃；
任选的，第二次孵育的时间为3～8分钟；优选的，第二次孵育的时间为5分钟；
任选的，离心的时间为0.5～2分钟；优选的，离心的时间为1分钟。
4.一种亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述方法提取DNA后进行荧光定量PCR检测。
5.权利要求4所述亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的引物和探针为SEQ ID NO:1～4所示序列；
任选的，所述荧光定量PCR的20μL反应体系为：10μL的2×TaqMan Fast AdvancedMaster Mix、浓度为300nM的引物、浓度为250nM的探针、2μL待测样本，余量为无菌水；
任选的，所述荧光定量PCR的反应程序为：50℃2min；95℃20s；95℃3s，60℃30s，循环40次；50℃1min。
6.一种用于亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，包括裂解液，SEQ ID NO:1-4所示序列的引物和探针。
7.权利要求6所述用于亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒，其特征在于，所述裂解液的配方为5～100mM的Tris-HCl，1～50mM的EDTA，0.01～0.5％w/v的表面活性剂，50～250μg的蛋白酶K，20～200mM的氯化铵，10～200mM的氯化钠，pH值为6.5～8.5；优选的，表面活性剂为SDS或NP-40或Brj-35。
8.一种权利要求6所述用于亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性检测的试剂盒的使用方法，其特征在于，取检测样本全血加入裂解液；52-57℃下第一次孵育；92-98℃下第二次孵育；然后离心得到DNA；再荧光定量PCR检测即可。
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