[发明专利]一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。所述组合产品包括引物和锁核酸探针，其中锁核酸探针的5'端第4、6、7、8和10位核苷酸为锁核酸。此引物和探针组合产品可检测的扩增子更短，检测突变的阴阳性同时，还可以获得样本中该突变的比例，具有灵敏度高、特异性强等优点。本发明的试剂盒能够为EGFR基因T790M突变肺癌患者的治疗提供用药指导、药效评估和疗效检测，有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测人类EGFR基因T790M突变的组合产品、组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

随着分子生物学的迅速发展，人们对肿瘤的认识达到了分子水平。许多肿瘤相关基因己被发现，肿瘤药物的靶向治疗也得到了很好的疗效，根据不同药物的疗效与肿瘤基因类型有相关性，采取检测肿瘤基因类型能帮助临床医生采取精准的治疗方案。美国食品药品监督管理局于2003月批准了美国阿斯利康(Aotrazeneca)公司生产的小分子基因靶点药物吉非替尼(Gefitinib，也称为易瑞沙/Iressa)用于治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)。吉非替尼是一种口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，它对EGFR突变的肺癌患者有很好的治疗敏感性，通过抑制该酶的活性来抑制肿瘤的增长、增殖，却无明显的化疗副作用。

但是据估计，约30-40％的亚洲NSCLC患者在确诊时携带EGFR突变，高达2/3的患者在接受当前己上市的EGFR-TKI治疗后，病情进展产生T790M耐药突变，使得EGFR-TKI失去了治疗效果，疾病无法控制。(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有抵抗的EGFR T790M突变阳性(EGFR基因外显子20第790位密码子出现C>T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸，T790M)、手术无法治愈的或复发性非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗。所以服用EGFR-TKI的肺癌患者需要定期检查T790M突变，监控EGFR-TKI耐药进展，帮助医生选择最佳治疗方案，避免耽搁治疗有效时机。

目前检测EGFR基因突变最常用的样本来源是肿瘤的病理组织或细胞学标本，但是组织取材均为有创操作，有时难以实施，且这些操作受肿瘤大小、部位、患者一般情况等影响，有时不能取得满意的组织或组织量太少不能进行基因突变检测。并且随着疾病的进展EGFR-TKIs耐药性的出现，常常需要再次进行分子生物学检测，而组织取材为有创操作，不能使捷、反复进行。近些年循环肿瘤DNA(ctDNA)被认为是一种可能代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA进入外周血。ctDNA用于肿瘤突变检测优势在于：操作无创，在疾病的任一进程中都可获取；可以作为一种肿瘤标记物，实现实时检测和动态监测；克服肿瘤组织的异质性。因此，使用外周血游离DNA监测患者EGFR基因突变状态，探索患者EGFR-TKI耐药机制及预测预后成为一条可行的途径。然而，目前使用ctDNA检测EGFR基因突变仍有一些技术上的缺点与挑战：

1)血液检测中，ctDNA含量较低；

2)ctDNA片段相对小，约为180bp；

3)在不同的肿瘤组织中，ctDNA含量差异很大；

4)ctDNA中肿瘤相关的DNA所占比例不同人差别较大，并且常因比例小而难以测出；

5)以前的研究显示，与肿瘤组织相比，ctDNA检测EGFR突变灵敏度仅为43-66％。因此，高灵敏度的ctDNAEGFR基因突变检测技术的发展十分重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容