[发明专利]猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括预包被猪细小病毒VLPs的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。

2.根据权利要求1所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述猪细小病毒VLPs通过以下步骤制得：

1)对猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备pUC-VP2重组质粒；

2)利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2；

3)将重组质粒pSMK-VP2转化大肠杆菌并诱导表达得到VLPs。

3.根据权利要求2所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，猪细小病毒毒株结构蛋白VP2基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求2所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，利用pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒构建重组质粒pSMK-VP2具体为：

1)将pUC-VP2重组质粒按照如下酶切体系进行酶切：pUC-VP2质粒35μL，Bsa I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL；

将pSMK载体质粒按照以下体系进行酶切：pSMK载体质粒35μL，Bsa I 2.5μL，Cutsmartbuffer 5μL，ddH2O 7.5μL；

上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认pUC-VP2重组质粒和pSMK载体质粒切开后，回收基因VP2目的片段和pSMK表达载体；

2)将基因VP2目的片段和pSMK表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：VP2目的片段4μL、pSMK表达载体1μL、5μL Solution I，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；

3)将连接产物转化Trans5a克隆菌；

4)将Trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2。

5.根据权利要求4所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述将连接产物转化Trans5a克隆菌具体为：

1)将5μL连接产物加入100μL Trans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；

2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；

3)加入42℃预热后的LB液体培养基800μL，于37℃震荡培养1h；

4)离心机4500rpm离心3min；

5)弃除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB琼脂平板上；

6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。

6.根据权利要求4所述的猪细小病毒VLPs ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述将过夜培养后的菌液通过全菌PCR法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒pSMK-VP2具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μL PCR缓冲液体系中，利用全菌PCR法进行鉴定，将PCR反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：pSMK-VP2重组质粒6μL，Xba I 1.5μL，Xho I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h，重组质粒pSMK-VP2双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒pSMK-VP2。