[发明专利]一种DNA的文库定量及测序方法

权利要求书

1.一种DNA的文库定量及测序方法，其特征在于，包括：

步骤一：做处理表单、样本和试剂耗材准备；

步骤二：根据定量表找出对应的样本,按顺序排列；准备1.5ml低吸附管,加入499uINF水,核对编号及NF水量；融化的样本振荡混合均匀,瞬离至管底,加1uL样本至499uLNF水中,核对管号,振荡混匀稀释完的样本,瞬时离心；在冰盒上配MIX,并分装18uLMIX到放置在金属冰盒上的0.2mlPCR板中；核对好编号,吸取2uL样本到18ulMIX中；封好膜后离心2min,放入荧光定量PCR仪中进行检测；

步骤三：根据所述步骤二中的定量检测结果,制作上机表单,同一个pooling表上不能存在相同标签，选择合适的pooling混合体积,进行pooling；乳液PCR1平衡融化后振荡离心,依次加入80uLNF水,乳液PCR酶120uL，振荡1min混匀的微珠溶液100uL,稀释混匀后的pooling文库100uL；混匀乳液PCR混合溶液,枪调800ul，分三次加入FILTER中,剩余样本离心后用200ul枪加入到FILTER中,加200ul隔离油；选择好程序PROTON-HQ-200KIT程序,进行乳液PCR；

步骤四：OT下机处理,首先进行10分钟钟离心；2C1磁珠室温平衡30min，水洗测序仪，0T下机处理，OT下机离心好的样本对着非沉淀处吸至剩余150ul样本,把剩余样本吹匀转到1.5ml低吸附管中；加入200uNF水至收集管中,冲洗管壁,重复冲洗次，振荡收集到的样本,15500rcf离心8分钟；观察是否有沉淀,留100ul样本,加900uINF水,振荡,15500rcf离心8分钟；留20ul样本加80ul模板垂悬液,振荡并瞬时离心；

步骤五：将样本模板和试剂等按照操作流程表依次加入八连管中；下ES后15500rcf5min,留10uL,加200uLNF水,振荡混匀,15500rcf5min,留10uL加90uLNF水,振荡4℃保存备用；

步骤六：加5uL质控微珠,混匀15500rcf5min,留10uL加15uL退火缓冲液,20uL测序引物振荡瞬离,退火；加10uL上样缓冲,混匀,瞬离；清洗芯片,使用NF水清洗3次,异丙醇清洗3次,清洗进样孔,N2吹干；Loading样本,离心10min，按照操作流程表进行配液,吹泡泡、清洗后加酶65UL孵育5min,选择对应的plan,进行上机测序。

2.根据权利要求1所述的DNA的文库定量及测序方法，其特征在于，所述步骤二中还包括：①表单处理核对样本编号和标签号,重复标签样本高亮显示；NF水加过后对比每管的液体体积,液面高度一致；分装液体体积为每孔18uL,加模板时注意核对每管样本的重复孔数；定量结果复孔差异大的需要重定量。

3.根据权利要求2所述的DNA的文库定量及测序方法，其特征在于，还包括以下注意事项：OT下机处理时珠子在有柄柄的一侧,吸取残液时注意枪头位置；

ES时观察枪头是否有C1和珠子络合的现象；

ES时注意八连排管的方向,检查是否放置收集用的离心管；

Loading时注意观察是否有气泡残留,如有需要多冲洗一次。

4.根据权利要求3所述的DNA的文库定量及测序方法，其特征在于，所述步骤四还包括：离心的8miin需要准备ES富集需要的试剂和耗材,清洗C1磁珠,开启ES仪。

5.根据权利要求1所述的DNA的文库定量及测序方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：选取已建库未定量样本,重上机样本,需重定量的样本加入定量表,原则上一张定量表上不能出现超过两个的标签重复；找出待定量的样本,融化备用；定量试剂放置4℃C冰箱融化。