[发明专利]一种Atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法

说明书

本发明公开了，一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加Notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化，为明确atoh1a标记的细胞类群为斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的前体细胞提供在体实验依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法。

背景技术

神经原基因(proneural gene)atoh1a，属于bHLH家族转录因子，在脊椎动物毛细胞命运决定过程中起关键作用。已有研究表明，atoh1是毛细胞命运决定因子，过表达atoh1可以诱导过多毛细胞产生，缺失atoh1毛细胞无法形成。在斑马鱼侧线系统形成过程中，FGF信号可以起始Notch信号通路配体delta A表达。Delta A和Delta D两者同时激活临近细胞的Notch信号通路，抑制 atoh1a表达，表达atoh1a的细胞最终将发育成毛细胞(haircells)，其临近 Notch信号活化的细胞因不能表达atoh1a将发育成助细胞(supportcells)，这就是Notch信号通路通过Atoh1a在毛细胞命运决定过程中所起的“侧向抑制”作用(lateral inhibition)。Atoh1a和Notch信号在侧线毛细胞命运决定过程中的作用和内耳中毛细胞命运决定的作用类似。

在哺乳动物中感觉毛细胞丢失或功能受损通常导致不可逆听力损伤或听力障碍。哺乳动物毛细胞只有有限的再生能力，小鼠只有前庭毛细胞(vestibular hair cells)可再生，耳蜗毛细胞(cochlear hair cells)基本不可自然再生。斑马鱼侧线毛细胞在耳毒性药物损伤后可完全再生，且侧线毛细胞在形态和功能上类似哺乳动物内耳毛细胞，研究发现一些导致侧线毛细胞功能障碍的基因突变后同样可导致人类的听力障碍。因此探究斑马鱼侧线毛细胞再生将有利于对毛细胞再生规律的解读。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法。

本发明的技术方案是：

一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加Notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化。

作为优选的技术方案，所述atoh1a反义核苷酸探针合成具体为设计引物扩增atoh1amRNA片段，连接Ez-T载体，构建质粒，该质粒经线性化后，纯化回收，以该线性化质粒为模板，经T7聚合酶体外转录合成地高辛标记的反义探针，该探针经RNA Cleanup kit纯化回收，加入RNase inhibitor-80℃保存。

作为优选的技术方案，所述整胚原位杂交与抗体染色共染方法具体为取10 条斑马鱼样本，经4％PFA固定过夜，加入地高辛标记的atoh1a反义链探针孵育过夜，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小时，后加入BCIP和NBT 底物避光显色；待显色完全后，加入ddH2O终止反应，并用PBS润洗2次；接着用封闭液PBDT×+2％goat serum室温阻断1小时，加入抗体rabbit anti-Parvalbumin3于4度孵育过夜，第二天取出后加入二抗Alexa488 goat anti-rabbit IgG(H+L)室温孵育6小时，去除二抗后，用PBDT×溶液润洗样本2×15min，最后将样本置于1×PBS溶液中，Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜成像。