[发明专利]一种Atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法

权利要求书

1.一种atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述方法利用atoh1a反义核苷酸探针，通过整胚原位杂交的方法，观察顺铂诱导斑马鱼侧线毛细胞死亡及再生过程中atoh1a的表达图式，并通过原位杂交和抗体染色共染的方法观察atoh1a的表达细胞类群与神经丘中心成熟毛细胞的空间关系，进一步通过外源添加Notch信号抑制剂观察atoh1a表达增多的情况下再生毛细胞数目的变化。

2.根据权利要求1所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述atoh1a反义核苷酸探针合成具体为设计引物扩增atoh1amRNA片段，连接Ez-T载体，构建质粒，该质粒经线性化后，纯化回收，以该线性化质粒为模板，经T7聚合酶体外转录合成地高辛标记的反义探针，该探针经RNA Cleanup kit纯化回收，加入RNaseinhibitor-80℃保存。

3.根据权利要求1所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述整胚原位杂交与抗体染色共染方法具体为取10条斑马鱼样本，经4％PFA固定过夜，加入地高辛标记的atoh1a反义链探针孵育过夜，第二天加入碱性磷酸酶偶联二抗室温孵育4-5小时，后加入BCIP和NBT底物避光显色；待显色完全后，加入ddH2O终止反应，并用PBS润洗2次；接着用封闭液PBDT×+2％goat serum室温阻断1小时，加入抗体rabbitanti-Parvalbumin3于4度孵育过夜，第二天取出后加入二抗Alexa488goatanti-rabbit IgG(H+L)室温孵育6小时，去除二抗后，用PBDT×溶液润洗样本2×15min，最后将样本置于1×PBS溶液中，Zeiss Axio A1倒置荧光显微镜成像。

4.根据权利要求1所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述斑马鱼为野生型鱼系Tübingen，侧线毛细胞特异性标记的转基因鱼系为SqET4。

5.根据权利要求1所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述顺铂浓度为1mM。

6.根据权利要求1所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述Notch信号抑制剂为DAPT。

7.根据权利要求6所述的atoh1a在斑马鱼侧线毛细胞再生过程中的表达图式的方法，其特征在于：所述DAPT浓度为50μM。