[发明专利]大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用

说明书

本发明公开了大肠杆菌表达载体pRTDuet‑1，所述表达载体由pETDuet‑1构建而来，其中pETDuet‑1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。还公开了表达载体pRTD‑G，其由pRTDuet‑1构建而来，还包括了目的基因，目的基因为6‑磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。本发明还提供上述两种表达载体的构建方法。所构建出的表达载体可在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达目的基因，可以作为基因改造的可选质粒。

技术领域

本发明涉及及基因工程领域，具体为大肠杆菌表达载体、构建方法及其应用。

背景技术

随着人类对原核生物的认知，越来越多的微生物种类被发现。为了改造这些微生物，穿梭表达载体的构建已得到相当多的关注。大肠杆菌是一种易于培养，生物量容易积累的比较常见的原核细菌，且容易对其进行基因改造和重组，因此常用的穿梭质粒都是基于特定菌株和大肠杆菌之间构建。现有的大肠杆菌表达质粒大多基于T7聚合酶进行外源基因高效表达，但是在其他宿主细菌上往往并不存在T7聚合酶，而往往只能挑选该细菌自带的质粒进行改造，从而限制了大肠杆菌表达系统的应用。

发明内容

本发明的目的是提供表达载体pRTDuet-1和表达载体pRTD-G及其构建方法，所述载体能够在不含T7聚合酶基因的大肠杆菌中表达。

为解决上述技术问题，本发明提供一种大肠杆菌表达载体pRTDuet-1，所述表达载体由pETDuet-1构建而来，其中所述pETDuet-1的T7聚合酶启动子被沼泽红假单胞菌的磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子替代。

优选的，表达载体pRTDuet-1具有序列号1所示的序列。

本发明还提供一种大肠杆菌表达载体pRTD-G，所述表达载体由权利要求2所述的pRTDuet-1构建而来，所述pRTD-G还包括目的基因，所述目的基因为6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因。

优选的，所述目的基因来自于沼泽红假单胞菌。

优选的，表达载体pRTD-G具有序列号2所示的序列。

本发明还提供表达载体pRTDuet-1以及表达载体pRTD-G的构建方法，包括步骤：

(1)获得重组载体1，所述重组载体1包括了将pETDuet-1质粒MCS II区T7启动子替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段；所述重组载体1具有序列号3所示的序列；

(2)获得重组载体2，所述重组载体2包括了将pETDuet-1质粒MCS II区和MCS1区的两个T7启动子均替换为沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子的含酶切位点的片段和pETDuet-1多克隆位点区域片段，所述重组载体2具有序列号4所示的序列；

(3)重组载体2和pETDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTDuet-1质粒；

(4)获得重组载体3，所述重组载体3为含6-磷酸葡萄糖脱氢酶(g6pdh)基因的片段；所述重组载体3具有序列号5所示的序列；

(5)将重组载体3与pRTDuet-1质粒分别酶切，将酶切后片段连接后获得pRTD-G质粒。

优选的，所述步骤(1)具体为根据沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子序列和pETDuet-1质粒酶切位点设计两段式扩增引物1与扩增引物2；两段式扩增沼泽红假单胞菌磷酸烯醇式丙酮酸激酶启动子，获得两段启动子片段，连接两段启动子片段，获得连接产物；将连接产物与克隆载体pBM20-T连接，获得重组载体1；所述引物1具有序列号6/7所示序列，所述引物2具有序列号8/9所示序列。